正交实验优选红蓝草多糖提取工艺研究

韦 正洪海梅潘立卫蒋利荣

（1.河池学院化学与生物工程学院，广西 宜州 546300；2.微生物及植物资源开发利用重点实验室，广西 宜州 546300；3.桂西北特色资源研究与开发广西高校重点实验室，广西 宜州 546300）

正交实验优选红蓝草多糖提取工艺研究

韦 正1，2，3洪海梅1，2，3潘立卫1，2，3蒋利荣1，2，3

（1.河池学院化学与生物工程学院，广西 宜州 546300；2.微生物及植物资源开发利用重点实验室，广西 宜州 546300；3.桂西北特色资源研究与开发广西高校重点实验室，广西 宜州 546300）

采用硫酸-苯酚法测定红蓝草多糖的含量，用正交设计法筛选和优化红蓝草多糖的提取工艺。以料液比、提取时间、溶液的pH值、提取温度作为因素，进行L9(34)正交试验。各因素对提取红蓝草水溶性多糖的影响为：提取温度＞料液比＞提取溶剂pH值＞提取时间。确定较优提取工艺为料液比为1:40（m:v），提取温度100℃，提取时间为2h，提取溶剂pH值4.5，在该工艺条件下，红蓝草多糖的得率为8.018%，说明红蓝草除了主成分紫蓝素类、黄酮类外，其多糖的含量也较高。

红蓝草；多糖；提取工艺

红蓝草Peristrophe roxburghiana(Schult.)Bremk.，为爵床科红丝线草属植物[1]，又名红丝线，其汁液为天然染料之一[2]。红蓝草具有清肺止咳，凉血止血，散瘀止痛等作用，其主要含有多糖、生物碱、黄酮类、三萜、甾体及其苷类、苯丙素类、挥发油、醌类化合物、醇、有机酸等化学成分[3-10]。在研究的蓝草多糖提取工艺文献报道较少，大都报道研究其总黄酮及色素的提取工艺，故本文拟以正交设计法优选出合理较佳的多糖提取工艺条件，旨为红蓝草的开发和利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent Cary 8454 UV-Vis二极管阵列分光光度计(美国Agilent公司)；电子分析天平AE240S (十万分之一)， BP121S(万分之一)( 梅特勒-托利多仪器有限公司)；SSY-4型电子恒温水浴锅 (北京泰克仪器有限公)；pH计pHS-3B型(上海精密科学仪器有限公司)；SB25-12D 型超声波清洗器 ( 宁波新艺超声设备有限公司)；循环水式多用真空泵SHB-III型(郑州长城科工贸易有限公司)。

1.2 材料

苯酚、95%乙醇、甲醇、浓硫酸、柠檬酸、磷酸氢二钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，所用水为去离子水，其他试剂均为分析纯。葡萄糖对照品对照品(均购于成都曼斯特生物制品公司，纯度均＞98%，批号为A00308-20)。红蓝草药材采购于宜州市十字街药材市场，经河池学院化学与生物工程学院植物学覃国乐副教授鉴定为爵床科红丝线草属植物Peristrophe roxburghiana(Schult.)Brem红蓝草。

2 方法与结果

2.1 红蓝草的预处理

将烘干的红蓝草粉碎后过80目筛，备用。取一部分用95%乙醇浸提2h进行脱脂，抽滤，在60℃恒温烘干24h后，放于干燥器中备用

2.2 红蓝草多糖的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

取葡萄糖对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加水制成每1mL含0.100mg的溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备

取药材粉适量1.0g，精密称定，置250ml圆底烧瓶中，加水20ml，100℃下回流提取90min，趁热过滤，溶液定容至250ml，即得。

2.2.3 最大吸收波长的确定

将葡萄糖对照品与供试品经苯酚-浓硫酸处理后，于400～600nm波长下扫描，结果对照品与供试品均在490nm处有最大吸收，故选取490nm为测定波长。

2.2.4 标准曲线的绘制

分别精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，置于具塞试管中，加水补足至2ml，摇匀，加5%苯酚溶液1ml，摇匀，再迅速加入浓硫酸5ml，摇匀，放置10min，于90℃水浴保温15min，取出，冷水迅速冷却，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法在490nm波长处测定吸光度，吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程y=52.484x-0.0306，R=0.9991，结果表明葡萄糖在线性范围内与吸光度呈良好的线性关系。

多糖含量（%）=(A-0.0306)/52.484*8/0.3*250/1000/ m*100%，

式中：A为供试品溶液的吸光度值（ABS）、m为供试品药材取样量（g）。

2.2.5 精密度试验

精密量取对照品溶液1.0mL，照“2.2.4”的方法，自“加水补足至2mL”起，依次显色、测吸光度值，重复测定吸光度值6次，计算吸光度值的RSD为0.67%，表明精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取药材粗粉约1.0g，精密称定，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，取0.3mL供试品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水补足至2mL”起，依次显色、测吸光度值，在0、0.5、1、2、6、12h分别测定吸光度值，测得多糖含量的RSD为1.32%。实验表明样品溶液在12h内基本稳定。

2.3 单因素考察

2.3.1 料液比考察

取药材粉约1.0g，精密称定6份，置圆底烧瓶中，加入不等量蒸馏水1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1：40；100℃下回流提取2h，趁热过滤，定容至250ml，取2ml定容至25ml，得样品溶液，取0.4ml样品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水补足至2ml”起，依次显色、测吸光度值。由图1 可知，料液比为30倍之后，红蓝草多糖提取率趋于平缓，选择适宜料液比为1:30。

图1 料液比考察结果

2.3.2 提取时间考察

取药材粗粉约1.0g，精密称定6份，置烧瓶中，加入20mL蒸馏水，100℃条件下回流提取不同时间后，趁热过滤，滤液定容至250ml容量瓶，取2mL定容至25mL，得样品溶液，取0.3mL样品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水补足至2mL”起，依次显色、测吸光度值。从图2可以看出，提取时间对红蓝草多糖提取率影响较弱，随着浸提时间的延长，多糖提取率呈平缓的趋势，选择适宜的提取时间为2h。

图2 提取时间考察结果

2.3.3 提取温度考察

从图3可以看出，随着浸提温度的升高，多糖提取率逐渐增大，当温度上升为100 ℃时，多糖提取率达到最高。因此，最佳提取温度为100℃，红蓝草多糖的提取率最佳。

图3 提取温度考察结果

2.3.4 提取溶剂pH值考察

不同温度条件下回流提取，结果得出在提取溶剂pH值为4.5条件下，红蓝草多糖的提取率最佳，如图4所示。

图4 提取溶剂pH值考察结果

2.3.5 提取次数对多糖提取率的影响

由图5可知，随着提取次数的增加，多糖的提取率呈平滑上升趋势，但提取次数超过1次后多糖提取率增加缓慢，因此， 选择最适提取次数为1次。

图5 提取次数考察结果

2.4 正交实验

通过前期的单因素实验结果，确定了料液比、回流提取时间、提取溶剂的pH值、提取次数、提取的温度，结果显示提取次数对多糖提取率无显著影响，故确定提取次数为1次。浸提工艺以料液比、回流提取时间、提取溶剂的pH值、浸提温度为因变量，设计法设计四因素三水平实验。实验方案设计和结果见表1、表2。

表1 正交设计因素与水平

表2 正交设计因素与水平

表3 方差分析

由表2、3可知，提取温度对红蓝草多糖的提取结果影响最大，料液比次之，提取时间影响较小；其最佳的提取条件为A3B2C2D3，即料液比为1:40（m:V），提取温度100℃，提取时间为120min，提取溶剂pH值4.5，提取次数1次。

2.5 验证实验

在最佳工艺条件下，取药材粗粉约1.0g，试精密称定6份，进行6次重复性实验，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，取0.3mL供试品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水补足至2mL”起，依次显色，分别测定其吸光度值，其含量分别为8.2349%、8.1384%、8.2543%、8.1724%、7.9103%、8.3634%，平均提取率为8.018%，多糖含量的RSD为1.87%。说明该工艺稳定

2.6 加样回收率实验

准确吸取取已知多糖含量（以验证试验平均值计算）的药材粗粉6份，每份约0.05g，精密称定，精密加入适量对照品溶液，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，取0.3mL供试品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水补足至2mL”起，依次显色，分别测定其吸光度值，计算多糖含量。由表4可知，回收率为94.78%，说明红蓝草多糖测定方法可行。

表4 红蓝草多糖加样回收率试验结果（n=6）

3 讨论

本文以多糖提取率为考察指标，采用正交实验优化了红蓝草多糖热水浸提工艺。最终确定红蓝草多糖的最佳提取工艺为：料液比为1:40（m:V），提取温度100℃，提取时间为120min，提取溶剂pH值4.5。分析实验结果得出料液比、提取时间、提取温度、提取溶剂pH值4.5对多糖提取率有不同程度的影响，其中提取温度、料液比影响最显著，各因素间存在不同程度的交互作用。该方法比较直观、方便，实验精度高，同时也说明红蓝草除了主成分紫蓝素类、黄酮类外，其多糖的含量也较高，为红蓝草的开发和利用提供依据。

[1] 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草:第7卷[M].上海:上海科学技术出版社,1999:466-467.

[2] 苏仕林,马博,黄珂,等.桂西壮族染色植物民族植物学研究[J].中国农学通报,2013,29(11):203-207.

[3] 谢运昌,蒋小华,文永新,等.紫蓝素化合物、其制备方法及其用途[P].CN:03117188.5,2005.

[4] 马河.紫蓝素纯化工艺及质量控制研究[D].湖南长沙:湖南中医药大学,2006.

[5] 徐玉琳,林颖,周诚,等.UV法测定狗肝菜与红丝线草的多糖含量[J]中药新药与临床药理,2008,19(5): 387-389.乏一定的理论知识，并且教师的专业水平也较低，那么其培养出来的学生往往是专业水平较低的学生。由此可见，教师的专业水平、理论水平是非常重要的。

当前，“双师型”教师是学校较为缺乏一种类型，因此学校要重视对教师的培养。在技能比赛中，笔者会发现：有的教师自身的实践操作水平较高，但是其自身的理论水平较低；有的教师自身的实践操作水平、理论水平却都比较低。所以学校要重视教师的培训，在培训中来提升教师的专业水平。

学校在培养“双师型”教师队伍的时候要采取以下的措施：第一，安排老师到企业锻炼，不断提高老师的专业水平。第二，学校要安排专门的时间让教师参加专业培训班，在培训之后要考核老师，只有考核通过的教师才可以继续任职。第三，从企业聘请有经验的员工来担任该专业的老师，从而可以将一些实际操作中遇到的问题告诉学生。第四，构建科学的奖惩机制，及时表扬在工作中表现突出的教师。

（4）借助技能大赛来提高毕业生的就业竞争力

技能大赛的目的在于引导学校重视技能训练，促使学生的技能水平得以提高。在大赛中，学生可以将自身的才能展现出来，并且企业也可以了解到学生，从而便于企业选拔人才。在比赛时，学校要邀请企业来当评委，并且要召开现场招聘会，这样做既为学生提供了就业机会，又便于企业从中选取更多优秀的人才。在平时的课程设置中，学校要充分考虑到企业的实际需求，从而提高毕业生的就业竞争力。

3 结束语

建筑工程类技能大赛不仅推动着学校课程体系的改革，还推动着学校教学方式的改革。与此同时技能大赛这一模式具有明显的操作性，因此在参赛过程中学生的实践操作能力得到了明显的提高。

【参考文献】

[1] 倪颐.浅谈职业技能大赛引领职业教育模式的变革效应[J].神州,2014,(8):258-259.

[2] 赵炎.高职校技能大赛对教师专业发展影响的研究[J].四川职业技术学院学报,2012,(5):73-75.

[3] 卢育英,曹智.基于技能大赛引领作用的职业教育研究[J].天津职业院校联合学报,2014,(4):83-85.

[6] 徐玉琳,王俊华.红丝线草挥发油化学成分气相-质谱联用技术分析[J].时珍国医国药,2003,14(4):206-207.

[7] 谢运昌,蒋小华,张冕.红丝线挥发油的化学成分[J].广西植物,2008,1l(1):697-700.

[8] 暴惠宾.红丝线化学成分研究[D].南宁:广西大学,2009.

[9] Singh S R,Pandey P R,Singh K R,et a1.Aliphatics from Peristrophe bicalyculata[J]. Fitoterapia,2000,71(1):80-81.

[10] Alexander N,Lebuhna S,Schwerdtfeger M,et a1.Phylogenetic constraints vsecology in the nectar composition ofAcanthaceae[J]. Flora,2007,(202):62-69.

Optimize Extraction Process of Polysaccharide in Peristrophe roxburghiana(Schult.)Bremk.

To optimize the extraction process of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana. Sulfuric acid - phenol method is used to determine the content of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana. The influence of solid- liquid ratio、temperature、 time and extraction solution pH on extraction yield of the polysaccharide in Peristrophe roxburghiana were discussed with orthogonal test method. The impact sequence of the factors on the extraction rate of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana was as follows: temperature＞solid-liquid ratio＞extraction solution pH＞time; The optimal extraction condition was extraction temperature of 100℃、solid- liquid ratio of 1:40、extraction time of 2h and extracted solution pH=4.5. Under these optimal conditions,the extracting rates of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana is 8.018%.The content of polysaccharide is high which can be exploited and utilized as another new ingredient.

Peristrophe roxburghiana ; polysaccharides; extraction process

R284.2

A

1008-1151(2015)03-0068-03

2015-02-11

广西教育厅高校科学技术研究项目(KY2015YB265);校级课题(2014QN-N001)。

韦正（1986－），男，河池学院助教，从事民族药品质与药效相关性研究、药物分析、中药化学成分与质量标准化研究。