普通野生稻花器性状及异交结实性分析

孙佩甫+郎越+裴新梧+袁潜华

摘要：以7个普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）和3个栽培稻（Oryza sativa L.）为材料，研究普通野生稻的花器性状和异交结实率及其相关性。结果表明，普通野生稻的花药长度和宽度、柱头长度和宽度及花粉量均比栽培稻大，但其花粉粒大小、花粉活力、花粉可育度和套袋自交结实率均比栽培稻小。相关分析结果表明，普通野生稻的花药长度与花药宽度、花粉量与花药宽度、柱头长度与柱头宽度、柱头宽度与花柱夹角分别呈显著正相关，花粉可育度与花粉活力呈极显著正相关；普通野生稻与栽培稻的异交结实率与其花器性状和套袋自交结实率之间无显著相关性。

关键词：普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）；花器性状；自交结实率；异交结实率

中图分类号：S511 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2317-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.004

普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）是目前中国三种野生稻中分布最广的一种野生稻，一般分布在热带、亚热带等温度相对较高、雨量充沛的地区[1]，尤其以海南省的分布密度最大，在海南省绝大部分县（市）如海口、文昌、万宁、东方等地区均有广泛分布。普通野生稻长期在自然条件下适应环境的变化，具有复杂的遗传背景和丰富的遗传多样性，含有高产、优质、抗病虫、耐逆境等优异基因， 是亚洲栽培稻（Oryza sativa L.）育种的重要基因源[2]。普通野生稻与栽培稻同属AA型基因组，亲缘关系较近，两者杂交可以获得种子，转基因水稻可以通过花粉扩散向普通野生稻产生基因漂流[3]。外源基因逃逸到作物的野生近缘种中可直接或间接地影响这些野生种群的遗传和生态适应性，进而影响该野生种群的生态和进化方向[4]，因而一些研究者开展了水稻向野生稻的基因漂流研究。在田间自然状况下，Song等[5]，Chen等[6]和Wang等[7]对栽培稻或转基因水稻向普通野生稻的基因漂流进行了评估。结果表明，向普通野生稻的最大基因飘流频率分别为2.94%，1.21%～2.19%和11.24%～18.00%，数值介于向不育系和常规稻的基因漂流频率之间[8]。从不同研究者的研究结论来看，漂流频率有着较大差异，这种差异主要是因为研究者采用了不同的普通野生稻居群作为受体材料，而遗传多样性较高的普通野生稻是高度杂合的群体[2，7]，其群体中存在部分不育株和半不育株，且野生稻的柱头外露率高、容易接受外来花粉[9]，因此在基因漂流研究中作为受体的野生稻居群不同。会产生不同的基因漂流研究结果。为了客观比较和评价转基因水稻向不同普通野生稻的基因漂流频率，有必要研究同等试验条件下、不同居群普通野生稻与栽培稻在人工杂交授粉条件下的异交结实率，比较不同普通野生稻居群与栽培稻的杂交亲和性，进而评价基因漂流率差异及其原因。另一方面，普通野生稻的花器性状是否通过影响异交结实率来影响基因漂流率是值得关注的问题，已有相关学者研究了杂交水稻不育系花器特征与异交结实率的关系，但未见对普通野生稻的花器性状与异交结实率关系的相关报道。因此需要对普通野生稻的花器性状、自交结实率及与栽培稻的异交结实性进行相关分析，这对于水稻育种中野生稻资源利用和转基因水稻向普通野生稻的基因漂流研究均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验采用7个居群的普通野生稻和3个栽培稻品种（系），普通野生稻包括海南海口、文昌、东方H、东方B（相同县市普通野生稻编号以村名首字母为代号，以区别同一地区两种不同的野生稻居群）、万宁和广西桂平、来宾居群。栽培稻包括杂交水稻恢复系9311（扬稻6号）、3550和转bar基因水稻Bar9311（简称B9）。其中9311为两系杂交稻恢复系，生育期适中，花粉量中等，株型集散适中，茎秆粗壮，穗大粒重，生育后期光合优势强[10]。3550的生育期中等，茎秆粗壮，株型好；抗稻瘟病，恢复力强；配合力好，穗粒数多，开花散粉时间长[11，12]。B9为抗除草剂的转基因籼稻品种，中国科学院亚热带生态研究所肖国樱教授用基因枪法将bar基因导入两系杂交早稻恢复系D68，获得抗除草剂草铵膦的水稻恢复系 Bar68-1、从9311×Bar68-1分离后代中，筛选出抗除草剂的稳定株系，该株系生育期长、株高较高、穗长、穗粒数多、产量潜力大[13]，3种栽培稻是研究异交结实的良好材料。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 2013年，供试材料于海南大学农学院海甸试验基地进行播种，为了使供试材料花期相遇时间较长，分别在7月13日、7月19日、7月24日和7月28日对3种栽培稻分期播种。每期每品种10行，每行10株，行距约为16.7 cm×20.0 cm。

1.2.2 柱头和花药形态性状的测定 在普通野生稻和栽培稻的开花期，随机选取参试材料的不同稻穗中上部的5个即将开花的颖花制片[14]，在ZEISS Primo Star显微镜下配合AxioCam ERc 5s对柱头和花药进行拍照，用Image-Pro Plus软件测量柱头长度、柱头宽度、花柱夹角、花药宽度和长度。

1.2.3 花粉相关性状的测定 于7：00～8：00随机采集稻穗插入盛有适量水的锥形瓶中，选取颖花，将单个颖花中的全部花药放入1.5 mL 离心管中，加入1.0 mL去离子水，10 000 r/min离心 2 min，再涡旋混匀，用2.5 μL移液枪吸取1.0 μL溶液滴在载玻片上[14，15]，在显微镜下计数其中的花粉数量，根据稀释倍数计算单个花药的花粉量。在显微镜下结合测量软件测定花粉粒直径，即花粉粒大小。采用I2-KI染色法测定花粉可育度[16-19]，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测量花粉活力[20]。endprint

1.2.4 自交结实率和人工杂交结实率的测定 调查稻穗套袋自交结实率和人工异交结实率，使用透明、防雨、透气的羊皮纸袋并固定羊皮纸袋于竹竿上，防止大风折断穗茎[21]。测定人工异交结实率需要采用温汤去雄并结合剪颖法并进行人工辅助授粉，当普通野生稻开花时，用高20 cm的保温壶装满45 ℃的温水，温汤5 min[22]，一次浸泡2～4穗普通野生稻的稻穗，使花粉致死，并剪去颖壳的1/3便于接受花粉。采集7：00～9：00的栽培稻植株花粉以捻穗法对野生稻进行离体授粉2～3 d[23]。每个居群的野生稻设置2穗空白对照，采用温汤去雄并剪颖，但不进行授粉。于授粉后第25～30天收集种子，计算人工异交结实率。使用SPSS软件统计测量数据并进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 普通野生稻、栽培稻花药和柱头形态性状比较

由表1可知，普通野生稻居群中花药长度为4.40～6.24 mm，栽培稻的花药长度为1.99 mm～2.63 mm，普通野生稻的花药长度均值（5.09 mm）较栽培稻花药长度均值（2.37 mm）长2.72 mm，所有供试的普通野生稻花药长度均较栽培稻长。普通野生稻花药宽度为0.42～0.93 mm，栽培稻的花药宽度为0.53～0.65 mm，栽培稻的花药宽度均值（0.60 mm）较普通野生稻的花药宽度均值（0.68 mm）小0.08 mm。供试材料中普通野生稻的柱头长度为1.50 ～2.79 mm，栽培稻的柱头度长为1.26～1.77 mm，普通野生稻的柱头长度均值（1.97 mm）较栽培稻的柱头长的均值（1.55 mm）长0.42 mm。普通野生稻柱头宽度为0.45～0.92 mm，栽培稻中柱头宽度0.35～0.48 mm，普通野生稻的柱头宽度均值为0.68 mm，除了文昌的柱头宽与栽培稻的柱头宽相近，其余的普通野生稻柱头宽均较栽培稻的长。普通野生稻的花柱夹角均值为112.4°，较栽培稻的花柱夹角均值（92.6°）大19.8°。可见普通野生稻的花药长和花药宽、柱头长和柱头宽均比栽培稻长，花柱夹角的均值也略大于栽培稻。

2.2 普通野生稻和栽培稻的花粉相关性状及套袋自交结实率的比较

由表2可知，供试材料中普通野生稻的花粉粒大小为37.95～43.67 μm，栽培稻的花粉粒大小为44.91～46.82 μm，栽培稻的花粉粒大小均值（45.93 μm）较普通野生稻的均值（40.76 μm）大5.17 μm（表2）。有相关研究表明栽培稻的花粉粒大小为36～56 μm，多数在42～50 μm的范围内[24]，本研究的栽培稻的花粉粒直径在多数水稻花粉粒大小的范围内，但普通野生稻的花粉粒直径偏小。

普通野生稻居群中花粉数量为1 938～3 683粒，栽培稻的花粉量为605～1 315粒。杨弘远[24]调查了4个栽培稻品种的一个花药内约有1 000粒左右的花粉量，与本研究的栽培稻的花粉量基本一致，其中栽培稻3550的花粉量偏小，而普通野生稻的花粉量远大于栽培稻的花粉量。栽培稻品种中花粉可育度在91.34%以上，花粉活力在86.18%以上，而普通野生稻的花粉可育度为23.34%～94.58%，花粉活力为37.97%～94.63%，两项指标的均值均较栽培稻小。

普通野生稻居群的自交结实率为15.05%～62.21%，均值为31.89%，变化范围比较大；栽培稻的自交结实率在69.86%～74.12%，均值为72.51%，且变化范围较小，表明栽培稻品种套袋自交结实率稳定。栽培稻的自交结实率明显较普通野生稻高，可能与栽培稻经过长期的人工农艺性状选择有关。另一方面，栽培稻的花粉粒大小较普通野生稻大，且花粉可育度和花粉活力均较普通野生稻大，花粉粒贮存的淀粉等营养物质多，因而其花粉粒萌发能力及花粉管伸长均具有优势，从而更容易受精结实。

2.3 普通野生稻与栽培稻的异交结实性分析

以普通野生稻为母本、栽培稻为父本进行人工杂交。本试验中对普通野生稻先进行人工去雄，再进行人工授粉，配置杂交组合，各组合的异交结实率见表3。由表3可知，空白对照所获得的杂交种子均为0，说明人工杂交过程中去雄效果好，无自交结实现象的干扰。杂交组合中来宾×9311异交结实率最高，为11.24%，说明在这些组合中来宾与9311亲和性最好，桂平×B9（5.26%）和桂平×9311（4.97%）也较高，而海口与三种栽培稻的异交结实率很低，文昌×3550的异交结实率为0，杂交亲和性最差。普通野生稻与栽培稻的异交结实率不同，说明栽培稻与不同普通野生稻的亲和性不同。同时不同栽培稻与同一种普通野生稻的异交结实率也有差异。

根据表3数据可以求得所有普通野生稻与栽培稻杂交的平均异交结实率。B9、9311和3550的平均异交结实率分别为1.67%、3.26%和1.04%，以9311平均异交结实率最大，最小为3550。普通野生稻与所有的栽培稻的平均异交结实率大小依次为来宾（4.48%）>桂平（3.77%）>东方B（2.80%）>东方H（1.02%）>万宁（0.90%）>文昌（0.53%）>海口（0.40%）。广西来宾和桂平的平均异交结实率相对最高，海口最低。海南野生稻中以东方B、东方H较高，其他的海南野生稻的平均异交结实率均低于1.00%。广西普通野生稻居群与栽培稻的平均异交结实率均比海南居群高，说明两地的普通野生稻与栽培稻的异交结实能力差异较大。

2.4 普通野生稻套袋自交结实率与其花器性状的相关性分析

用SPSS统计软件对测量的普通野生稻的花器性状和自交结实率数据进行相关分析，结果如表4所示。相关性分析结果表明，花药长度与柱头长度、花粉量与花药宽度、柱头长度与柱头宽度、柱头宽度与花柱夹角呈显著正相关（表4）；花粉可育度与花粉活力呈极显著正相关。前人研究表明，TTC染色法是检测水稻花粉活力最佳方法之一，其测定值与离体培养法的测定结果相近[25]，本研究得出花粉活力和花粉可育度高度相关，说明TTC染色法和I2-KI染色法均为检测水稻花粉生活力和成熟度的有效方法，成熟的花粉活力较高。普通野生稻的自交结实率与其花器性状无显著或极显著相关性，但与花粉量呈低度负相关，可见普通野生稻的花粉数量多并不能表示其具备较多的有活力的花粉。endprint

2.5 普通野生稻异交结实率与其雌蕊形态性状的相关性

普通野生稻与3种栽培稻的异交结实率的相关性分析表明，普通野生稻（与栽培稻）的异交结实率和普通野生稻的雌蕊形态性状的相关性未达到显著水平（表5），与其自交结实率也无显著的相关关系。但普通野生稻与不同栽培稻的异交结实率与柱头长等雌蕊形态性状的相关系数存在差异，说明普通野生稻的异交结实率与栽培稻的品种选择有关。

3 小结与讨论

不同研究者对于水稻基因漂流进行了研究，但获得的基因漂流频率有较大差异。而基因漂流频率实际上在某种意义上反映了异交结实率，理论上异交结实较好的材料更容易接受外来花粉，形成较高的基因漂流频率。为了比较不同居群普通野生稻的漂流频率，研究栽培稻与不同普通野生稻居群的异交结实率是必要的。但普通野生稻是杂合体[2，7]，一些群体中存在部分不育和半不育株，为了防止自身花粉影响到异交结实，需要人工去除自身可育花粉，对普通野生稻先采用温汤等方法去雄，再行人工授粉杂交，以获得真实的异交结实率。

在田间自然状况下，栽培稻或转基因水稻向普通野生稻的最大基因飘流频率为1.21%～18.00%， 该数值介于向不育系和常规稻的基因漂流频率之间[5-8，26]。本试验通过栽培稻与不同普通野生稻的人工杂交，研究普通野生稻的异交结实率，其范围为0%～11.24%，平均值为1.99%。但需要指出的是，尽管基因飘流频率与试验的异交结实率属性相似，但计算方法有较大差异。在转基因水稻基因漂流研究过程中，其试验设计一般是在试验中心设一个转基因稻样方， 周围种植非转基因稻或其亲缘种，于水稻成熟期在不同方向的不同距离上取一定面积的样方或一定数量的植株或种子， 分析植株或成熟种子转基因存在的频率[27]，即作为转基因传粉的频率，以评价外源转基因通过授粉杂交途径的扩散过程。这种方法会因外来花粉（或自身花粉，如野生稻）竞争大小造成结实率高低不同，从而影响基因漂流频率的计算值。但如果参试的受体为杂交水稻的不育系时，由于不育系自身无可育花粉或者无花粉，其结实率高低受外来花粉多少的影响较大，而当周围无常规水稻竞争花粉、只有转基因供体花粉的情况下，授粉全部来自于转基因花粉源，结实的子粒全部或绝大部分为转基因种子，只有极少数来自于不纯的不育系杂株，这样估算的基因漂流频率往往偏高。对于杂合群体的普通野生稻，群体中不育株或半不育株的数量将影响到竞争花粉的数量，进而影响基因漂流频率。而异交结实率反映的是受体异交结实的能力，在自然条件下其接受的花粉既可来自普通野生稻自身，也可来自外来花粉。本试验中人工异交结实率远低于其套袋自交结实率，除了与杂交亲和性有关外，可能还与人工去雄对普通野生稻雌蕊器官造成伤害进而影响授粉有关。

普通野生稻自交结实和异交结实的研究中，大田试验中下雨天气往往使套袋潮湿甚至霉变，影响受（授）精结实，造成空粒或杂交稻穗的损失，而且普通野生稻植株较高且茎秆细小易折使人工辅助授粉困难，使得人工去雄杂交过程非常艰难，样本数量难以达到栽培稻之间进行人工杂交获得种子的数量级。

影响异交结实的花器性状很多， 柱头外露率是其中非常重要的因素。在杂交水稻制种中一般围绕提高母本柱头外露率、 父母本开花时相遇率等调节措施来提高制种产量， 并改进授粉技术。龙俐华等[28]以三系不育系为材料， 研究结果表明， 杂交水稻制种中柱头外露率与异交结实率呈极显著相关（r=0 .966 7）。但不同居群的普通野生稻的柱头外露率均较高，差异较小，大多高于95%[29]，因此本研究不考虑柱头外露率与其他花器性状及自交、异交结实率的关系。

水稻的柱头长宽、花药长宽与柱头夹角等花器形态性状与异交结实率的相关研究表明，粳稻三系不育系的异交结实率与其花柱长度呈极显著正相关，而花药长与柱头长、柱头长与柱头宽无显著相关性[30]；恢复系柱头长宽与花柱夹角无显著相关，而花粉量与花药长度呈极显著线性正相关（r=0.911 2），与花药宽度的正相关系数虽然也很高，但未达到显著水平（r=0.679 7）[14]。本试验对普通野生稻雌蕊花器性状和自交结实率相关性分析结果表明，普通野生稻的花药长与柱头长、柱头长与柱头宽、柱头宽与花柱夹角、花粉量与花药宽分别呈显著正相关，花粉可育度和花粉活力呈极显著正相关。异交结实率与自交结实率和雌蕊花器形态性状的相关分析表明，普通野生稻的雌蕊形态性状对其（与栽培稻的）异交结实率和自交结实率无显著影响，这与张忠旭[14]和全东兴等[30]在杂交水稻上的研究结果有差异。

柱头活力关系到花粉飘落到柱头之后能否萌发、花粉管能否生长，所以柱头活力直接关系到受精的成败。普通野生稻的柱头活力也应影响其异交结实进而影响基因漂流率。在植物界中，柱头活力持续时间的长短因植物种类而异，水稻一般能维持6～7 d，以开花当天相关活力最强，以后逐渐下降。在杂交水稻制种实践中，不育系柱头活力强有利于异交结实和制种产量的提高[31，32]。研究柱头活力一般针对不育系材料， 对不育系的颖花进行处理， 通过人工授粉的结实率高低来衡量开花后不同天数的外露柱头活力。但对于野生稻， 由于自身含有可育花粉，通过异交结实率判定柱头活力或会导致误差， 若用温汤去雄等方法也会在一定程度上伤害柱头等雌蕊器官， 影响柱头活力研究的准确性。因此对野生稻柱头活力的评价方法尚有待于进一步研究。

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