GEF7基因过表达拟南芥植株幼苗表型分析

摘要：利用已构建的过表达拟南芥（Arabidopsis）GEF7基因植株，在光照培养箱中进行培养，并与野生型植株进行对比分析，对GEF7基因过表达植株的幼苗表型进行了观察分析。结果表明，GEF7基因过表达植株幼苗的根长比野生型对照明显增加；其子叶形态、数目和幼苗形态等方面均有异常表型，表明GEF7基因的功能与根的发育有关，并参与调控植物的发育过程。

关键词：拟南芥（Arabidopsis）；GEF7基因；根；植物生长发育

中图分类号：Q945 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2511-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.056

Rac/ROP GEFs（Guanine nucleotide exchange factor）称为Rac/ROP鸟嘌呤核苷酸交换因子，是小G蛋白Rac/ROP的上游活化因子，能催化小G蛋白由GDP结合态转化为GTP结合态。Rac/ROP作为一种分子开关调节植物多种生长发育以及参与多种信号途径，其中包括调节花粉管的生长、根毛的发育、过氧化氢的产生以及参与生长素、脱落酸等植物激素的信号转导途径[1]。拟南芥基因组中存在14个Rac/ROP GEFs基因，是近年来鉴定的一个新的基因家族[2]。关于植物Rac/ROP GEFs生物学功能的研究目前比较少，仅有Rac/ROP GEFs调控拟南芥、烟草和番茄花粉管的极性生长的报道[3]。聂芳[4]已经构建了GEF7P-GUS转基因植株，通过GUS组织化学染色法分析GEF7基因的表达模式，发现GEF7基因主要在幼苗根的分生组织和维管组织、侧根原基和根毛细胞表达，且经生长素（NAA）诱导处理后，在上述细胞的表达显著增强。因此，本研究对GEF7基因表达植株的幼苗根系发育情况进行分析，同时对转基因植株的表型也进行了观察分析，旨在为阐明GEF7基因功能的奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 GEF7基因过表达拟南芥植物种子来自华南农业大学植物激素信号转导分子机理实验室。

1.1.2 试剂及仪器 Trypton 和Yeast Extract 购自OXOID公司，卡那霉素（Kan）购自广州康龙公司，其余试剂均为国产分析纯产品。荧光显微镜（BX51，OLYMPUS公司），光照培养箱（XT5408，杭州雪中炭公司），超净工作台（SW-CJ-1F，苏州净化设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 GEF7基因过表达植株幼苗根系发育分析 利用已构建的35S-GEF7 T1代阳性苗继续繁殖至T3代，转基因种子和野生型种子消毒后，在超净台内用无菌水清洗数次，将种子倾倒于灭菌滤纸上，保持滤纸的湿润。将种子播种至1/2平板上（添加50 mg/L卡那霉素），将种子排成一条线并保持一定间距（便于后面侧根数目观察），将平皿放入光照培养箱内，竖立培养3～9 d，在显微镜下观察苗的主根长度，进行拍照，运用ImageJ软件测量苗的主根长度。

1.2.2 GEF7基因过表达植株幼苗表型分析 筛选得到35S-GEF7 T1代阳性苗后，继续筛选繁殖后代，以期得到纯合子。期间观察35S-GEF7植株T1、T2、T3代的幼苗的表型，以野生型（WT）为对照。

2 结果与分析

2.1 GEF7基因过表达植株幼苗根系发育分析

以GEF7基因过表达植株的各株系幼苗进行根系发育分析试验，发现GEF7基因过表达植株在幼苗期主根的长度明显长于野生型对照（图1A）。对过表达及野生型对照的3、7、9 d幼苗的主根长度在显微镜下进行了定量分析，结果见图1B。正常的野生型植株分生组织区域的细胞通常通过垂周分裂来加长细胞组成的纵向行列，可以进一步在显微镜下对幼苗主根的分生组织进行观察，找出导致主根长短差异的原因。推测在过表达植株根分生组织区域可能分裂方式发生变化，也可能是分生组织细胞数目发生了变化。

2.2 GEF7基因过表达植株子叶和幼苗发育分析

野生型拟南芥幼苗的子叶通常是两片，并且大小对称（图2A），表型微弱的35S-GEF7幼苗常出现各种异常形状的子叶，如两片子叶大小不对称（图2D）、子叶钻石型（图2F）等；表型严重的35S-GEF7幼苗会出现一片子葉（图2E）、三片子叶（图2B）甚至子叶融合（图2C）等现象（这些表型35S-GEF1植株也都有，GEF1和GEF7都是Rac/ROP GEFs基因家族中的成员）。

野生型拟南芥幼苗的两片子叶对称打开，两叶柄之间形成一个较大的角度（图3苗1、6）。35S-GEF7幼苗的表型有：下胚轴膨大（类似于乙烯的效应）（图3中苗2～5）；两叶柄很宽，且夹角很小（图3苗2）；子叶发育缺陷，如子叶肥厚、不能伸展（图3苗5），或一片子叶发育不全（图3苗3、4）；无根或根很短的苗较少（图3苗7、8）等。

GEF是小G蛋白Rac/Rop的上游活化因子，GEF7基因过表达的幼苗表型与ROP组成型活化态的表型一致，暗示着GEF7可能在小G蛋白ROP调控器官的发育中起作用。

3 结论与讨论

3.1 GEF7与生长素信号途径

GEF的直接靶蛋白是Rac/Rop GTP酶，它能够催化Rac/Rop由GDP结合的非活化态转变为GTP结合的活化态，活化的小G蛋白可以和下游的各种效应分子相互作用，进而执行不同的细胞生理功能。Tao等[5]、Himanen等[6]阐明了ROP GTPase参与生长素信号途径的新机制，位于细胞膜的ROPGTPase其活性受生长素调节，其被生长素活化后，通过Aux/IAAs选择性降解，从而介导生长素诱导基因的表达。有研究表明，拟南芥GEF12在调节花粉管生长的过程中与上游受体激酶AtPRK2a作用并将信号传递给下游的ROP GTPase[7]。当GEF7基因过表达时，幼苗主根显著增长，表明Rac/Rop GEF7可能参与生长素介导的根发育的信号途径，这需要进一步的试验来证明，如对35S-GEF7转基因植株的根进行激素敏感性试验等。

3.2 GEF7与植物器官发育

植物中ROP GTPase作为一种分子开关调节各种各样生理功能以及参与各种信号途径，其中包括调节花粉管的生长、侧根的发生，根毛的发育、过氧化氢的产生、细胞骨架的组装以及参与生长素、脱落酸等植物激素信号轉导途径[8-10]。GEF7基因过表达的植株子叶和幼苗表型呈现出各种异常形态，其中含有类似乙烯效应的表型，推测GEF7可能在小G蛋白ROP调控器官的发育中起作用。

参考文献：

[1] TAO L Z，CHEUNG A Y，WU H M.Plant Rac-like GTPases are activated by auxin and mediate auxin-responsive gene expression[J].Plant Cell，2002，14：2745-2760.

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[3] YANG Z.Small GTPases：Versatile signaling switches in plants[J].Plant Cell，2002，14：375-388.

[4] 聂 芳.拟南芥Rac/Rop GEF7基因功能研究[J].安徽农业科学，2010，38（16）：8314-8316.

[5] TAO L Z，CHEUNG A Y，CANDIDA N， et al. RAC GTPases in tobacco and Arabidopsis mediate auxin-induced formation of proteolytically active nuclear protein bodies that contain aux/iaa proteins[J].Plant Cell，2005，17：2369-2383.

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