响应面法优化蓝莓花青素提取工艺研究

齐计英　刘倩　韩静　孙华庚　万阅

摘要：为优化蓝莓（Vaccinium Spp）提取工艺，试验选用水浴回流提取方法，研究了乙醇体积分数、提取温度、提取时间和液料比等因素对蓝莓花青素提取的影响，并用Box-Behnken法进行了响应面优化。结果表明，蓝莓花青素水浴回流提取的最优工艺参数为乙醇体积分数59%、提取温度62 ℃、提取时间62 min、液料比8∶1，在此优化条件下蓝莓花青素的提取量为8.444 7 mg/g，与理论值8.453 1 mg/g相差不大。

关键词：蓝莓（Vaccinium Spp）；花青素；提取；水浴回流；响应曲面法

中图分类号：S663.9；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2473-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.045

蓝莓（Vaccinium Spp）又名越橘，其富含花青素而且种类丰富[1]。花青素（Anthocyanidin）又称花色素，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，多以糖苷的形式存在，也称花色苷[2]。蓝莓果实中的花色苷具有改善视力、延缓衰老、抗疲劳、抗癌和消炎作用[3]。据国内报道[4-6]，花青素具有抗氧化、清除自由基、抗突变活性、减轻肝功能障碍、降血糖以及抗肿瘤的功能。蓝莓色素具有纯天然效应和营养功能，应用于食品中安全性高，对人体无害，具有广阔的市场应用前景[7]。

响应面法是以多元二次回归数学模型为工具，能有效地找到因素间的最优组合，相比于传统的全因子试验设计，该法能在更为经济的试验次数下得到精确的统计结果，具有周期短、精确度高等优点[8]。本试验采用响应面法，以蓝莓花青素提取量为考察指标，对影响蓝莓花青素提取量的一些关键因素进行研究，探求水浴回流法提取蓝莓花青素的最佳工艺条件，以便于对蓝莓资源进一步开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

蓝莓，购于沈阳家乐福超市；原花青素标准品（UV≥98%），购于上海江莱生物科技有限公司；香草醛、无水甲醇、浓盐酸、无水乙醇、丙酮均为国产分析纯。

1.2 仪器

RRHP-200型高速万能粉碎机，欧凯莱芙（香港）有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器、SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；UV2800型紫外可见光分光光度仪，北京普析通用有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素含量测定 试验采用盐酸-香草醛法[9，10]。精确称取100 mg原花青素标准品，用去离子水溶解并定容至100 mL，用移液管移取原花青素溶液1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 mL，分别用去离子水定容至10.00 mL。再精密称量香草醛4.000 g，用甲醇溶解并定容至100.00 mL。取原花青素溶液1.00 mL，依次加入香草醛-甲醇溶液6.00 mL、浓盐酸3.00 mL。以甲醇溶液为空白对照，在500 nm 处测吸光度。

1.3.2 样品测定 准确称取蓝莓3 g，按一定的液料比（mL∶g，下同）加入到一定体积分数的乙醇，在一定温度下水浴回流提取一定的时间，真空抽滤后，滤液用真空旋转蒸发器浓缩至少于50 mL，转入50 mL容量瓶中并用相同体积分数的乙醇溶液定容至刻度，得到待测液。

1.3.3 单因素试验 分别考察提取溶剂、乙醇体积分数、提取时间、提取温度、液料比对花青素提取量的影响。

1.3.4 响应曲面法试验设计 根据单因素试验结果，以乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）4个因素为自变量，以蓝莓花青素提取量为响应值，利用Box-Behnken组合设计试验方案，进行水浴回流提取蓝莓花青素条件的优化，因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

根据所取标准品质量浓度和吸光度数据绘制原花青素标准曲线见图1。经数据处理分析获得原花青素标准曲线回归方程为：y=12.451x+0.002，r2=0.999。

2.2 提取溶剂对花青素提取量的影响

以70%甲醇、70%乙醇及70%丙酮为提取溶剂对花青素提取量的影响见图2。由图2可知，溶剂为70%乙醇的花青素提取量比溶剂为70%甲醇和70%丙酮的提取量略高。实际生产中，用乙醇代替了许多常用的溶剂如甲醇、丙酮、乙醚，因为这些试剂有毒性，不利于粗提取物在食品和药品中的进一步利用[11]，因此试验选择用乙醇作为提取溶剂。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 乙醇体积分数对花青素提取量的影响 不同乙醇体积分数对花青素提取量的影响见图3。由图3可知，最优乙醇体积分数为60%，在一定范围内，花青素的提取量随乙醇体积分数的增加而增加，当乙醇体积分数为60%时提取量最高，继续增加乙醇体积分数提取量反而降低。

2.3.2 提取时间对花青素提取量的影响 不同提取时间对花青素提取量的影响见图4。由图4可知，最优提取时间为60 min，在一定范围内，蓝莓花青素提取量随着提取时间增加而增加，超过60 min，花青素提取量反而降低。出现此情况的原因可能是浸提时间太短，花青素溶出不充分，导致提取液中花青素含量较低；而提取时间太长时，由于花青素稳定性较差，在没有抗氧化剂的溶液系统内，会诱导产生一系列的化学反应，部分花青素可能分解，提取量反而降低[12，13]。

2.3.3 提取温度对花青素提取量的影响 不同提取温度对花青素提取量的影响见图5。由图5可知，60 ℃为最优提取温度，在一定范围内，蓝莓花青素提取量随着温度的增加而增加，超过一定范围，花青素提取量反而降低。出现此情况的原因可能是由于温度低时，花青素与蛋白质、纤维等分离较慢，提取温度升高增加了化合物溶解性和扩散速率，减小了溶剂的黏度，有利于色素的溶出，故提取量升高；但花青素的稳定性较差，温度过高可能导致花青素发生氧化、聚合[14]，部分花青素可能分解，提取产量反而降低。

2.3.4 液料比对花青素提取量的影响 不同液料比对花青素提取量的影响见图6。由图6可知，7∶1为最优液料比，随着液料比的增大，蓝莓花青素的提取产量增加，但当液料比超过一定范围后，花青素提取量增加的不明显，继续增加甚至略有降低。其可能原因是液料比过大时，色素浓度下降，色素分子间作用力变小，其稳定性下降而容易分解，导致色素产量下降。由图6可知，在7∶1至11∶1之间，其花青素的提取量变化不大，考虑到工业化成本及高的液料比对后续的浓缩工作不便，选择液料比7∶1。

2.4 响应曲面法优化试验结果

根据表2结果，计算各项回归系数，以这些回归系数建立蓝莓花青素提取量与乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）4个因素的数学回归模型。方差分析结果见表3。由表2可以得出二次回归方程式为：蓝莓花青素提取量=8.33-0.099A+0.57B+0.32C+0.16D-0.04AB+1×10-2AC+0.39AD-0.24BC+0.042BD+0.078CD-1.11A2-0.08B2-1.21C2-1.27D2。由表3可知，模型的一次项B影响极显著，C影响显著，A、D影响不显著。从F值可以看出，单因素对提取量的影响顺序依次是B>C>D>A，即液料比>提取温度>提取时间>乙醇体积分数。二次项A2、B2、C2、D2影响极显著，交互项影响不显著。从整体分析，模型P<0.000 1，表明该二次多项回归模型高度显著；失拟项P不显著，表明模型与实际情况拟合较好。

对乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）4因子两两作交互作用分析，其响应面见图7。等高线的形状反映交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著[14]，乙醇体积分数和提取温度2因素之间、乙醇体积分数和提取时间2因素之间、提取温度和液料比2因素之间、提取时间和液料比2因素之间交互作用显著。

通过对以上获得的二次方程回归模型进行数学分析可知，蓝莓花青素水浴回流提取的最优工艺参数为乙醇体积分数59%、提取温度62 ℃、提取时间62 min、液料比8∶1，在此优化条件下，花青素的提取量的理论值为8.453 1 mg/g。为了进一步验证响应面分析法的可靠性，采用上述最优条件提取花青素，重复3次，测得蓝莓花青素提取量分别为8.445 1、8.446 0、8.443 0 mg/g，取平均值为8.444 7 mg/g，与理论值相比，相对误差较小。因此，采用响应面法分析优化得到的蓝莓花青素水浴回流提取的参数准确可靠，可用于实际操作。

3 小结

采用Box-Behnken的中心组合设计及响应面分析，建立蓝莓花青素提取的二次多项式数学模型。经检验证明该模型是合理可靠的，能够较好地预测蓝莓花青素提取量。利用模型的响应面及其等高线，对影响蓝莓花青素提取量的关键因素及其相互作用进行探讨，通过分析并考虑到实际操作的便利性得到的最终优化工艺参数为乙醇体积分数59%、提取温度62 ℃、提取时间62 min、液料比8∶1，在此优化条件下，花青素的提取量为8.444 7 mg/g。因此，采用响应面法分析优化得到的蓝莓花青素水浴回流提取的参数准确可靠，可用于实际操作，能有效减少工艺操作的盲目性，从而为进一步的工业化提取奠定基础，以便于对蓝莓资源进一步开发利用。

参考文献：

[1] 焦 龙，李玉伟.蓝莓果实中花青素提取方法的研究进展[J].北京农业，2011（3）：10-11.

[2] CASTA EDA-OVANDO A，PACHECO-HERN？魣NDEZ M L，？魣EZ-HERN？魣NDEZ M E P， et，al.Chemical studies of anthocyanins：A review[J].Food Chemistry，2009，113（4）：859-871.

[3] KALT W， FORNEY C F，MARTIN A， et al.Antioxidant capacity， vitamin C， phenolics， and anthocyanins after fresh storage of small fruits[J]. J Agric Food Chem， 1999， 47（11）： 4638-4644.

[4] WOOD J E，SENTHILMOHAN S T，PESKIN A V.Antioxidant activity of procyanidin-containg plant extracts at different pHs[J].Food Chemistry，2002，77（2）：155-161.

[5] SHRIKHANDE A J.Wine by-products with health benefits[J]. Food Research International，2000，33（6）：469-474.

[6] AGARWAL C，SHARMA Y，AGARWAL R.Anticarcinogenic effect of a polyphenolic fraction isolated from grape seeds in human signaling and cell-cycle regulation and induction of G1 arrest and apoptosis[J]. Molecular Carcinogeneis，2000，28（3）：129-138.

[7] 庞志申.花色苷研究概况[J].北京农业科学，2000，18（5）：37-42.

[8] 史妍妍，孙志礼，闫 明.响应面方法在可靠性灵敏度计算中的应用[J].东北大学学报（自然科学版），2009，30（2）：270-273.

[9] 李春阳，许时婴，王 璋.香草醛-盐酸法测定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究[J].食品科学，2004，25（2）：157-161.

[10] OANCEAA S，STOIAB M，COMANC D.Effects of extraction conditions on bioactive anthocyanin content of Vaccinium corymbosum in the perspective of food applications[J].Procedia Engineering，2012，42：489-495.

[11] 刘建平，杨晓敏.响应曲面法优化超声辅助提取油菜籽皮中的原花青素[J].精细化工，2011，28（7）：680-684.

[12] 陈炼红，伍 红，李明珠.紫薯花青素提取工艺优化研究[J].西南民族大学学报（自然科学版），2012，38（3）：396-400.

[13] 李浩明，高 蓝.紫甘薯色素的提取工艺与性质研究[J].中国食品添加剂，2003（4）：23-26.

[14] 朱会霞，孙金旭.Nisin液体发酵工艺条件的响应面分析优化[J].中国乳品工业，2009，37（8）：31-34.