利用SSR分子标记初步分析广西莪术种质资源的遗传多样性

杨妮　王建

摘要：利用简单重复序列分子标记技术对广西莪术（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）种质资源进行了遗传多样性分析。结果表明，筛选出的14对引物在50份广西莪术种质资源中共扩增出78个条带，其中60条呈现多态性，多态性比率为76.92%，反映出广西莪术种质资源在分子水平上存在较大的差异；广西莪术不同种质资源间的差异主要由遗传因素决定，但也与环境因素有关。聚类结果将50份广西莪术种质资源分成2大类，揭示了它们之间的遗传差异，这为今后广西莪术优良品种的选育提供了依据。

关键词：简单重复序列分子标记；广西莪术（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）；遗传多样性

中图分类号：Q943.2；Q949.71+8.33；Q16 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2408-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.027

广西莪术（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）为姜科（Zingiberaceae）姜黄属（Curcuma L.）植物，以干燥根茎入药，其味辛、苦，性温，具有行气破血、消积止痛的功效，可用于症瘕痞块、淤血闭经、食积胀痛等病征以及早期宫颈癌的治疗，是中医临床上较为常用的活血化瘀药材[1]。现代药理研究表明，广西莪术所含的莪术油是一种很有发展前途的抗肿瘤、抗血栓和抗病毒药物[2-4]。广西莪术是广西壮族自治区主产的地道药材，产区面积大，近年来关于莪术挥发油成分的研究越来越多，但对广西莪术的品种选育和种植技术改良未受到应有的重视。多年来，广西莪术育种工作侧重于常规技术，许多分子水平上的研究工作有待开展。试验利用简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记技术对产自于广西壮族自治区的50份广西莪术种质资源进行了遗传多态性分析，旨在揭示广西莪术种质资源的遗传多样性，以期为广西莪术选育高产优质新品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试广西莪术种质材料共有50份，是从多年收集到的广西莪术原始材料中选育出来的，分别采自广西壮族自治区的玉林市、兴业县、钦州市、灵山县、贵港市、桂平市、平南县、钦北区、横县、邕宁区、金秀瑶族自治县等地，从2000年起集中栽植于南宁市仙葫种植基地内。试验前其生长状况优良，有关信息见表1。经王建教授鉴定，并经过药材性状数据分析，参试的各样品确认为姜科植物广西莪术无疑。

1.2 基因组DNA提取

选取参试各种质材料生长状况良好的新鲜健康嫩叶，经前期消毒处理后提取DNA，提取方法参照经典的CTAB法[5]，稍加改良。提取所得总DNA于-20 ℃环境里保存。

1.3 引物筛选和SSR-PCR反应体系优化

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增引物参照文献[6]公布的姜黄属通用的17对引物选取，由上海生工生物技术工程服务有限公司合成，详见表2。随机选用10个参试的广西莪术种质材料，参照Komatsu等[7]的SSR扩增条件稍加改良进行引物筛选，从姜黄属通用的17对引物中选取扩增条带清晰、重复性好、多态性高的15对引物作为本次试验的引物。最终确定的PCR反应体系为：DNA模板3 μL、引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 6 μL（Taq DNA Polymerase）、Recombinant 0.05 units/μL、MgCl2 4 mmol/L、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）0.4 mmol/L、加dd H2O至15 μL。以此建立的SSR反应体系稳定、重复性好。PCR反应程序参照文献[8]，略有改动；扩增反应是在德国Biometra TProfessional PCR仪上进行，扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个扩增循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.4 凝胶电泳与染色

PCR产物在7%的聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE，5 μg/mL）中于200 V稳压里电泳45～60 min，凝胶电泳分离后进行银染，观察，并用Cano Scan 9 000 F扫描仪扫描得到图谱。

根据图谱分析各SSR位点的扩增情况，包括是否扩增、各位点在不同材料中所得到的等位基因数量。

1.5 遗传多样性分析

电泳扩增结果直接记录凝胶带型，并按基因型分别统计。选取清晰可辨的电泳条带，每条带代表引物与模板的1个结合位点，视每个多态性条带为1个等位基因，将观测到的每条带视为一个性状，有此带时赋值为1，无此带时赋值为0，将所有试验数据在Microsft Office Excel 2003软件里进行标准化处理，统计后将（0，1）矩阵输入分析软件里进行数据处理与分析。读出每对引物在广西莪术种质材料上产生的条带总数T、多态性条带P，并计算多态性条带比率PPB。多态性条带比率=多态性条带数目/条带总数×100%。采用NTSYS-pc 2.10软件构建数据矩阵，进行聚类分析。在Simint程序下选择Dice系数计算50份广西莪术种质材料间的遗传相似系数，采用非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）建立相应的系统树状结构，通过聚类划分类群来完成聚类分析。

2 结果与分析

2.1 姜黄属通用引物在广西莪术中的扩增情况

从17对公布的姜黄属通用引物中，筛选出在供试广西莪术种质材料中能产生较清晰主带的引物，共有15对，初步认为这些引物是有效引物，适用于广西莪术种质材料。利用这些引物对50份广西莪术种质材料统一进行PCR扩增，结果条带较清晰且有多态性的出现了14对。图1、图2分别为引物SSR-01、SSR-02、SSR-03和SSR-07、SSR-08、SSR-09的PCR扩增银染后扫描得到的电泳图谱。

2.2 SSR扩增图谱分析

利用14对引物对50份广西莪术种质材料进行多态性分析，结果见表3。从表3可见，14对引物在50份广西莪术种质材料中，每一条都能扩增出4～7条DNA片段，平均每对SSR引物扩增出了4.29 条，总共扩增出了78条，其中多态性条带60条，多态性条带比率为76.92%。这个结果表明，广西莪术各产地间种质材料（居群）的多态性较丰富，这与国外相关文献报道的印度姜黄（Curcuma longa L.）的扩增效果相近[9]，而国内姜黄属种群之间在遗传差异相关研究方面与国外研究相比，所得到的多态性位点总数要略低一些[10-12]。

试验结果表明，50份广西莪术种质材料间具有较高的遗传多样性，并且广西各地的广西莪术种质材料之间的遗传相似系数差别较大，说明各地的居群存在较明显的遗传分化。这和已报道的采用其他分子标记技术研究姜黄属遗传多样性的结果相似，即不同居群的姜黄属植物种的特性与地理分布具有一定的相关性。王佐元等[13]应用ISSR（Inter-simple sequence repeat）标记技术对5个居群的温郁金（C. wenyujin Y.H.Chen et C.Ling）遗传多样性进行了分析，筛选出6个引物用于ISSR-PCR扩增，结果共检测到多态性位点34个，多态性条带比率是80.95%，说明温郁金有着较丰富的遗传多样性。王晓慧等[14]对蓬莪术（C. phaeocaulis Val.）、广西莪术和温郁金共8个居群的37个样本进行了ISSR-PCR分析，5条引物共扩增出65个位点，其中34个位点是多态性位点，多态性条带比率为52.3 %；据此认为蓬莪术居群间的遗传变异较大，而居群内部的分化程度很低。本研究结果于上述研究存在相当的一致性。

2.3 UPGMA聚类分析

50份广西莪术种质材料的SSR扩增条带统计数据经NTSYS-pc 2.10软件聚类分析，得到聚类树状图，具体见图3。从图3可以看出，在遗传相似系数0.70处，参试的50份广西莪术种质材料可聚为2个大类。第一大类包含8份种质，在这一类中，除13-D2-2、86-B94-1、87-B10-2外，其余的都产自玉林市及管辖县兴业县；其中在遗传相似系数0.87处，55-玉1-3独自成为一类，说明55-玉1-3与其他第一大类的广西莪术种质材料的亲缘关系较远；而在遗传相似系数0.98处，26-加1和50-玉18-3聚在了一起，这2个材料可能来自同一亲本；在遗传相似系数0.95处，来源于钦州市的86-B94-1、87-B10-2聚在了一起，反映出它们是同一亲本产生的后代。第二大类包含42份种质材料，主要来源于平南，贵港，兴业，桂平等县（市），其中在遗传相似系数0.71处，42份种质又聚为2个亚类。其中来源于金秀县的37-C46-1，77-C24-1，79-C69-1，80-C104-1聚为1个亚类，与其他种质的亲缘关系较远；其余的38份种质在不同遗传相似系数处又可聚为多个次类，如在遗传相似系数0.93处可分为2个次类，第一次类包括了21份种质，分别来源于贵港、桂平、平南等县（市），这些种质由于所处的地理位置比较接近，因此当地生长环境及种植制度存在一定的相似性，进而也能表现出一定的遗传相似性。第二次类包括了62-玉22-2、64-C84-3、67-大一-3这3个种质，来自地域较接近的玉林市、兴业县。在遗传相似系数为1.00处，30-玉24-2、32-玉8-1、32-玉8-2、33-玉3-3、42-玉2-1聚为了1个小类，可以看出这几份种质的亲缘关系非常接近，猜测它们可能是同一株系的后代，它们的产地也相同，均来自玉林市。通过聚类分析图的完成，可以将无序的50份广西莪术种质材料进行分类，并能初步确定它们的亲缘关系远近。

3 讨论

以往研究表明姜黄属是三倍体[6]，多态性扩增结果也说明了广西莪术多倍体资源多态性相对比较丰富。但从聚类树状图来看，50份供试广西莪术种质材料间的遗传相似系数介于0.7～1.0，遗传相似性系数变化范围较窄；有研究[2，4]认为这与地理、生态环境相近、加之相互引种频繁等因素有关。此外，试验所用的引物数量偏少，因此选用的50份广西莪术种质材料的聚类结果并不能完全反映出不同来源种质间彼此的亲缘关系。广西莪术遗传背景复杂，通过常规的形态学方法对其进行分类存在一定的局限性。因此，对于广西莪术遗传多样性不仅要结合前期的形态学研究、药材产量、成分分析研究等方面进行深入探讨，还要充分利用近年来快速发展的分子标记技术做深层次的研究。试验利用SSR分子标记技术。从分子水平上分析了不同来源地广西莪术种质资源的遗传多样性.并对它们之间的亲缘关系进行了探讨，初步揭示了广西莪术种质资源之间的遗传差异，这将对广西莪术的优良地方品种鉴定筛选与新品种选育提供分子生物学依据。

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