铜基杀菌剂对柑橘炭疽病菌的室内毒力测定

郭洋洋 张宇宏 毛润乾 郑基焕

摘要：为确定铜基杀菌剂防治柑橘炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）的潜力，采用水平扩散法和生长速率法对3种铜基杀菌剂进行了室内毒力测定。结果表明，生长速率法可定量测定这3种铜基杀菌剂的毒力；77%氢氧化铜和30%琥胶肥酸铜在设定浓度完全抑制柑橘炭疽病生长，95%葡萄糖酸铜对柑橘炭疽病菌的抑制中浓度EC50=1.62 g/L，浓度不小于8 g/L时，可完全抑制柑橘炭疽病菌的生长。因此，3种铜基杀菌剂皆有防治柑橘炭疽病的潜力。

关键词：柑橘炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）；铜基杀菌剂；毒力测定

中图分类号：S482.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2384-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.020

柑橘炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）是一种普遍发生的真菌性病害，该病可为害柑橘树的叶、梢、花、果，不仅能引起田间的叶斑、落叶、枯梢、落果，还可以导致植株各器官的潜伏性侵染，严重影响树势和果实的产量与品质[1，2]。目前，防治柑橘炭疽病主要依靠化学防治，生产上多用苯并咪唑类和取代苯类杀菌剂[3，4]。但是，多年连续使用此类杀菌剂，炭疽病菌已对其产生了抗药性，防治效果不断下降[5，6]。因此，筛选出针对柑橘炭疽病的新型杀菌剂显得非常迫切。

铜基杀菌剂可通过释放铜离子杀灭病菌，是防治常见细菌和真菌性病害的一种理想药剂[7，8]。但要确定其是否可以用于防治柑橘炭疽病，首先要进行室内毒力水平的生物测定[9]。为此，用水平扩散法和生长速率法对3种铜基杀菌剂的毒力进行了测定，以期确定铜基杀菌剂用于防治柑橘炭疽病的潜力，为后续的大田试验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株由广西柑橘研究所采集病株，分离获得。经鉴定，其病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.），鉴定方式为培养性状和形态学特征观测[10]。

1.2 试验药剂

本试验采用3种铜基杀菌剂，分别为77%氢氧化铜，美国杜邦公司生产，商品名为可杀得；30%琥胶肥酸铜，由广东省昆虫研究所下属公司罗定市生物化工有限公司生产提供，商品名为溃枯灵；95%葡萄糖酸铜原粉，由北京信诺科美科技有限公司提供。供试真菌的培养与保存均使用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。

1.3 室内毒力测定

目前常用的室内毒力测定方法主要有水平扩散法和生长速率法[11，12]，其主要原理是将杀菌物质作用于细菌、真菌或其他病原微生物，根据抑制作用大小来判断药剂的毒力。

1.3.1 水平扩散法

1）杀菌剂的浓度梯度制作：准备无菌三角瓶，将杀菌剂按比例稀释成不同的浓度梯度，每种药剂设定20、40、60、80和100 g/L 5个浓度。

2）接菌：在超净台中，用接种针从供试菌的试管中挑取带有柑橘炭疽病菌的菌块，均匀点接到含PDA培养基15 mL、直径为20 cm的培养皿中。然后用打孔器打取滤纸片（直径5 mm）分别投入到配制好的供试药剂稀释液中吸附1 min，取出并将其靠在无菌的烧杯壁上，淌落多余的药液后移入凝固的培养基表面，每一培养皿对角排列放入4片吸附同一浓度药液的滤纸片，中央放一片吸附无菌水的空白滤纸。迅速盖上培养皿，用封条密封，在恒温培养箱中27～28 ℃培养24～48 h后观察结果。

1.3.2 生长速率法

1）病原菌的纯培养：在超净台中，用接种针从供试菌的试管中挑取带有柑橘炭疽病菌的菌块，点接到含PDA培养基15 mL、直径为 20 cm的培养皿中，迅速盖上培养皿，用封条密封，在恒温培养箱中27～28 ℃培养。当菌落分布均匀后，用无菌打孔器（内径5 mm）打孔，得到直径为0.5 mm的小菌饼。

2）含药培养基的制作：准备无菌三角瓶，将杀菌剂按比例稀释成不同的浓度梯度，在培养皿中加入上述的药液1 mL，然后再加入9 mL的PDA培养基，摇匀。每种药剂设定20、40、60、80和100 g/L 5个浓度。

3）杀菌剂毒力测定：将打制好的菌饼移入带药培养基平板，每一培养皿对角排列放入4个菌饼，同时设空白对照。

4）置于27～28 ℃恒温箱培养24～48 h，分别测定每个菌饼扩散的菌落直径。

5）根据杀菌剂浓度与供试菌的关系曲线，求得各杀菌剂浓度与抑制机率值间的毒力回归方程，再通过回归方程计算出各杀菌剂的EC50值。

1.4 数据测量与统计分析

用直尺十字交叉测量菌落的直径，以杀菌剂浓度的对数值为自变量，抑菌率的机率值为因变量，以最小二乘法建立毒力回归方程，求出各药剂的有效中量（EC50）。

2 结果与分析

2.1 水平扩散法试验结果

琼脂纸片扩散法的试验结果表明，3种铜基杀菌剂对菌丝生长均有抑制作用，但抑制形成的抑菌圈不呈规则的圆形，只能定性看出它们之间的差异。因此，此法不适合用于室内定量判断铜基杀菌剂对柑橘炭疽病菌的毒力（图1—图3）。

2.2 生长速率法试验结果

生长速率法的试验结果表明，柑橘炭疽病菌在加有设定浓度的77%氢氧化铜和30%琥胶肥酸铜的培养皿内生长均被完全抑制，95%葡萄糖酸铜对柑橘炭疽病毒力效果如图4。

测定每个菌饼扩散的菌落直径如表1，95%葡萄糖酸铜配制浓度20、40、60、80、100 g/L时，各浓度抑菌圈直径平均值分别为24.80、17.80、12.10、5.00和5.00 mm；抑制率分别为72%、88%、96%、100%和100%，机率值为5.582 8、6.175 0、6.750 7、8.091 2和8.091 2（表1）。由此可以得出毒力曲线（图5）。

经计算，95%葡萄糖酸铜对柑橘炭疽病菌的抑制中浓度EC50=1.62 g/L，即为1 620 mg/L。95%葡萄糖酸铜对柑橘炭疽病菌毒力作用曲线方程为：y=3.875 6x+4.159 69，R2=0.895 951，P=0.014 7。

其中，x为95%葡萄糖酸铜浓度对数；y为95%葡萄糖酸铜对柑橘炭疽病菌的抑制机率值；R2为拟合优度；P为0.05显著水平时解释变量的回归系数显著性t检验对应值，P<0.05，证明模型的线性关系显著（表1，图5）。

3 小结与讨论

目前，铜基杀菌剂已被用于防治多种细菌和真菌性病害，而且常与杀虫剂和其他杀菌剂混配，以达到减少农药用量、降低污染和减少成本的目的[13，14]。文中所述铜基杀菌剂中，氢氧化铜为无机铜杀菌剂，琥胶肥酸铜和葡萄糖酸铜为有机铜杀菌剂。其中，无机铜杀菌剂在使用中存在不能与酸性农药混配、易引起螨类和蚧壳虫猖獗和花期及幼果期易产生要害等不足[15]。而有机铜杀菌剂不仅兼有无机铜基杀菌剂传统优势，还有易自然降解、不伤害天敌“多毛菌”和与农药亲和性好等优势。因此，某些有机铜基杀菌剂可能成为新一代杀菌剂的最佳选择。

试验结果表明，77%氢氧化铜、30%琥胶肥酸铜和95%葡萄糖酸铜对柑橘炭疽病菌都有很强的抑制力。当3种铜基杀菌剂设定为20、40、60、80和100 g/L时，水平扩散法只能定性其对柑橘炭疽病菌的毒力。当用生长速率法试验时，77%氢氧化铜和30%琥胶肥酸铜在设定浓度梯度可完全抑制柑橘炭疽病菌的生长，无法做出相应毒力曲线，95%葡萄糖酸铜对柑橘炭疽病菌的抑制中浓度EC50=1.62 g/L，浓度不小于8 g/L时，可完全抑制柑橘炭疽病菌的生长。因此，以上3种铜基杀菌剂都可用于防治柑橘炭疽病，其中30%琥胶肥酸铜为首选。但是，室内环境条件与大田应用差异很大，故杀菌剂的室内毒力测定仅可作为新型药剂筛选的初步标准，田间应用还需可靠的大田试验。

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