预处理玉米秸秆连续酶水解与发酵工艺研究

张 全,关 浩,曹长海,唐开宇

(中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院生物化工部,辽宁抚顺 113001)

预处理玉米秸秆连续酶水解与发酵工艺研究

张 全,关 浩,曹长海,唐开宇

(中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院生物化工部,辽宁抚顺 113001)

本文以预处理玉米秸秆(PCS)为底物,设计建造了连续酶水解与发酵实验室装置,并利用该装置研究了3个体系的连续酶水解发酵过程。结果表明,干物质浓度(TS)21%/酶加量(EL)5.4%(酶和纤维素的质量百分比,下同)和25% TS/4.8% EL的两个体系分别在27 d和36 d(在表1内有体现)内达到稳定运行,乙醇浓度最高分别可达到2.8%和3.3%。36.8% TS/3.7% EL体系由于抑制物的影响无乙醇产生,但稳定运行时水解糖浓度可达到12.5%,达到了提高酶水解过程水解糖浓度的目的,表明连续酶水解发酵工艺可行。

预处理玉米秸秆,连续酶水解,纤维素酶,燃料乙醇

燃料乙醇是除了生物柴油外唯一目前大规模使用的生物液体运输燃料产品。中国《可再生能源发展“十二五”规划》中指出,2010年中国燃料乙醇产量达到180万吨。由于粮食的限制,中国已经不再批复粮食乙醇项目。木质纤维素类生物质作为地球储量最大的生物质原料,用来制备纤维素乙醇可部分解决原料来源问题[1-2]。目前,纤维素乙醇技术整体处在工业示范阶段,国内外已经有多套示范装置,加拿大Iogen公司从2005年开始在渥太华的加油站出售纤维素乙醇配制的乙醇汽油,到2013年累计生产纤维素乙醇1683 t[3],预计2014年世界纤维素乙醇产能将超过30万t/年[4]。纤维素酶水解过程中纤维素酶的成本、乙醇蒸馏过程的能耗,以及酶水解工艺的连续性一直是纤维素乙醇工业化的制约因素[5]。姚秀清等对植物纤维原料发酵生产燃料乙醇的各种间歇酶水解发酵工艺进行了详细描述[6],包括分段酶水解与发酵(SHF)、同步糖化发酵(SSF)、同步糖化共发酵(SSCF)和联合生物加工(CBP)等,目前间隙酶水解工艺能够用于生产,但是酶水解的效率低下,只能进行较低干物质浓度的水解,水解糖的浓度偏低,造成最终乙醇浓度低,影响后续蒸馏能耗,而且还有操作过程繁琐,设备利用率低、占地面积大、总电机搅拌功率大等弊端,因此有必要开发新型的连续酶水解工艺和装置。

Simone B.等对连续搅拌罐(the continuous stirred tank reactor,CSTR)和活塞流反应器(the plug flow reactor,PFR)用于木质纤维素原料酶水解液连续发酵的工艺进行了综述[7],丹麦inbicon公司开发了用于木质纤维素原料水解的连续酶水解工艺[8],但没有把酶水解和发酵过程整合连续运行的报道。本文在纤维素乙醇间歇酶水解与发酵工艺基础上开发了连续酶水解与同步糖化发酵相结合的工艺,可连续运行,其中卧式酶水解罐可实现高干物质浓度的酶水解过程,基于耐温酵母菌的同步糖化发酵缓解了高干物质浓度酶水解过程中葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制,提高了酶水解与发酵效率。

1 材料与方法

1.1 实验材料

预处理玉米秸秆(PCS):稀酸蒸汽爆破预处理,处理条件为180 ℃,0.8 MPa,停留时间5 min;TS 58.33%;纤维素含量,36.93%(g/g干基)。

纤维素酶:CTec2,购自诺维信,滤纸酶活(FPA)137 IU/g(国际单位)。

其它化学试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

分光光度计722S 上海分析仪器厂;水浴振荡器SHA-B 山东菏泽华兴仪器仪表有限公司;生化培养箱 SP-120 沈阳伟明医疗设备厂;高效液相色谱Agilent 1200 美国安捷伦公司;发酵罐Biotech-5M 上海保兴生物设备销售有限公司;生物安全柜NU-425-400E 美国NUAIRE公司。

1.3 菌株和培养方法

酿酒酵母FE-B,实验室筛选并保藏[9],CGMCC No. 2735。种子培养基(YPD):2%葡萄糖,2%蛋白胨和1%酵母膏,115 ℃灭菌30 min,备用。种子培养时从冰箱保存的斜面上在无菌状态下刮下一环接入,过夜培养即可。

1.4 分析方法

1.4.1 PCS干物质浓度测定 采用Mettler Toledo公司HG63水分测定仪烘干法测定。

1.4.2 纤维素酶活性测定 采用滤纸酶活(FPA),以国际单位(IU)表示,即在1 min内产生1 μmol葡萄糖所需的酶量为1 U[10]。

1.4.3 纤维素含量测定 采用美国可再生能源实验室(NREL)公开的两步酸水解法测定[11]。

1.4.4 糖和乙醇浓度测定 采用HPLC法同时测定酶水解液或发酵液中的葡萄糖、木糖、纤维二糖和乙醇浓度,葡萄糖、纤维二糖、木糖和乙醇标样购自Sigma公司。色谱条件:色谱柱,water Sugar PakⅠ;流动相,超纯水;流速,0.5 mL/min;柱温,65 ℃;检测器,RI;检测器温度,40 ℃。

1.4.5 纤维素水解率测定

式(1)

式中,Rh-纤维素水解率,%;Ms-水解糖质量,g;Mc-纤维素质量,g;常数1.1指葡萄糖与纤维素之间的换算关系。

1.5 连续酶水解装置

设计并建造用于PCS连续酶水解与发酵的实验装置。装置包括进料螺杆,卧式酶水解罐,立式酶水解发酵罐等,其中卧式酶水解罐体积为2.2 L,立式酶水解发酵罐的有效容积为2.2 L。

1.6 连续酶水解与发酵实验

分别以21%、25%和36.8%干物质浓度进行了连续酶水解与发酵实验。实验分为三个阶段。第一阶段利用进料螺杆往卧式酶水解罐中一次性加入2200 g PCS,控制卧式酶水解罐的温度为50 ℃,搅拌速率86 r/min,预先酶水解4 d。第二阶段,开启进料螺杆开始连续打入PCS,螺杆推进的压力使卧式酶水解罐的末端被部分酶水解的PCS压入到立式酶水解发酵罐中(控温50 ℃)。第三阶段,调节立式酶水解发酵罐的温度为36～38 ℃,接入酵母菌。根据每天进入的PCS质量与卧式酶水解罐和立式酶水解发酵罐的有效容积确定连续酶水解和发酵的停留时间,停留时间定义为:卧式酶水解罐或立式酶水解发酵罐体积(2200 mL)与每天进料量的比值。具体参数见表1。

表1 连续酶水解与发酵运行参数

注:
注:TS,干物质浓度;EL,纤维素酶Ctec2加入量,单位%;CH-Rt,连续酶水解停留时间;F-Rt,发酵停留时间;F-strart,开始发酵时间;Tt,运行时间。

2 结果与讨论

2.1 21% TS/5.4% EL体系连续酶水解与发酵

图1 21% TS/5.4% EL体系卧式酶水解罐出口葡萄糖和纤维二糖浓度随运行时间趋势Fig.1 Sugar concentration of hydrolysis liquid whichthrough out of horizontal digestion tank when hydrolyzedat the total solid of 21% and Ctec2 loading of 5.4%

从图1可知,前3 d卧式酶水解反应器出口的葡萄糖浓度呈线性上升,第3 d水解糖(葡萄糖和纤维二糖浓度之和)浓度为6.7%,但是连续运行时葡萄糖浓度降低,第8 d时趋于稳定,第8～27 d的平均水解糖浓度为5.7%,平均纤维素水解率为56.1%。葡萄糖浓度降低的原因可能是:进料速率过快;进料速率不均匀。

立式酶水解发酵罐中第7 d接入酵母菌FE-B种子,接种量为10 v%,接种方式为离心后接入菌泥。从图2可知,第7 d后葡萄糖浓度急剧降低,第10 d葡萄糖浓度降低到0.065%,乙醇浓度升高到2.4%,之后乙醇浓度稍有上升,最高点为2.8%,平均乙醇浓度为2.4%。

图2 21% TS/5.4% EL体系立式酶水解发酵罐糖和乙醇浓度随运行时间趋势Fig.2 Sugar and ethanol concentration of fermentation brothwhich through out of vertical digestion tank when hydrolyzedat the total solid of 21% and Ctec2 loading of 5.4%

2.2 25% TS/4.8% EL体系连续酶水解与发酵

从图3中可知,第4 d水解糖浓度为7.2%,第16 d趋于稳定,平均水解糖浓度为5.8%,平均纤维素水解率为46.7%。

图3 25% TS/4.8% EL体系卧式酶水解罐出口葡萄糖和水解糖浓度随运行时间趋势Fig.3 Sugar concentration of hydrolysis liquidwhich through out of horizontal digestion tankwhen hydrolyzedat the total solid of 25% and Ctec2 loading of 4.8%

图4显示了干物质浓度25%,酶加量4.8%体系立式酶水解发酵罐中乙醇浓度随时间变化趋势。第9 d接入酵母菌FE-B种子,接种方式同2.1,从图6可看出第12 d开始快速产生乙醇,第15 d乙醇浓度可达到3.3%,之后乙醇浓度有波动,32 d趋于稳定,保持在2.9%～3.2%之间,平均乙醇浓度可达到2.7%。

图5中显示了丹麦inbicon公司24% TS连续酶水解体系中葡萄糖浓度随运行时间趋势,从图5可知,该体系中葡萄糖浓度在进入连续进料阶段之间葡萄糖浓度为55 g/kg(约5.5%),后葡萄糖浓度也有下降,随后在30(约3.0%)～55 g/kg(约5.5%)之间波动,与本研究图3体系趋势相似,丹麦inbicon公司已经利用该体系建立了纤维素乙醇示范工厂,并取得了较好的效果。

图4 25% TS/4.8%EL体系立式酶水解发酵罐乙醇浓度随运行时间趋势Fig.4 Ethanol concentration of fermentation brothwhich through out of vertical digestion tankwhen hydrolyzedat the total solid of 25% and Ctec2 loading of 4.8%

图5 丹麦inbicon公司24% TS连续酶水解体系葡萄糖浓度随运行时间趋势[8]Fig.5 Glucose concentration in thecontinuous saccharification system byInbiconCorporationfromfrom Danmark

2.3 36.8% TS/3.7% EL体系连续酶水解与发酵

从图6可以看出,葡萄糖浓度随运行时间一直在上升,第16 d时葡萄糖浓度达到比较稳定的状态,水解糖浓度可达到12.5%,平均纤维素水解率52.6%。但是立式酶水解罐中酿酒酵母一直没有生长,无乙醇产生,可能是由于过高的TS造成水解液中抑制物浓度高,抑制酿酒酵母的生长。

图6 36.8% TS/3.7%TS体系卧式酶水解罐出口的葡萄糖和水解糖浓度随运行时间趋势Fig.6 Sugar concentration of hydrolysis liquid whichthrough out of horizontal digestion tank when hydrolyzedat the total solids of 36.8% and Ctec2 loading of 3.7%

2.4 PCS干物质浓度对连续酶水解的影响

图7显示了不同干物质浓度体系中连续酶水解与发酵对水解产糖和发酵产乙醇的影响。从图7可以看出,体系中水解糖的浓度随干物质浓度增加呈上升趋势,干物质浓度36.8%体系在连续酶水解过程中,平均水解糖浓度可达到12.5%。发酵产乙醇浓度在一定范围内随干物质浓度增加而增加,21%和25%干物质浓度体系中平均产乙醇浓度分别为2.4%和2.7%,当干物质浓度为36.8%时,体系不产乙醇,可能是由于干物质浓度增加时,体系中带入过多发酵抑制物抑制了酵母菌的生长。可通过如下方式解决:(1)酶水解之前对PCS进行水洗脱毒;(2)筛选耐受高浓度抑制物的发酵菌株;(3)采用较低干物质浓度进行酶水解发酵。李洪兴等[12]介绍了PCS中对微生物有抑制作用的化合物,并详细描述了应对抑制物、提高微生物发酵产量的措施及研究进展。PCS的脱毒,如萃取、水洗和石灰过中和等,通过驯化或基因工程构建等筛选方法获得可耐受抑制物的菌株,以及在发酵过程控制减少抑制物等都可以缓解抑制物对微生物发酵的影响。韩伟[13]等对不同干物质浓度的PCS酶水解液,利用酿酒酵母FE-B发酵乙醇,发现随着干物质浓度降低,发酵相同时间内,酶水解液中的残余葡萄糖浓度也降低,干物质浓度降低到一定程度后,葡萄糖可以完全被消耗,说明干物质浓度低的情况下,PCS引入的抑制物少,从而缓解甚至消除对酵母菌的抑制作用。

图7 体系干物质浓度对连续酶水解发酵产水解糖和乙醇浓度的影响Fig.7 Influence of total solids on the concentrationof sugar and ethanol product bycontinuous saccharification and fermentation

2.5 PCS停留时间对连续酶水解的影响

图8显示了利用进料螺杆连续进料时,停留时间对连续酶水解PCS纤维素水解率的影响。从图8可知,PCS的纤维素水解率随停留时间增加而增加,说明增加酶水解时间对PCS的纤维素酶水解有利,但是增加停留时间会降低设备利用效率,增加工艺成本,所以需要综合考虑较优的停留时间参数。

图8 停留时间对PCS纤维素水解率的变化趋势Fig. 8 The influence on cellulose hydrolysis rateby retention time

3 结论

设计建造了用于预处理玉米秸秆(PCS)连续酶水解与发酵的实验室装置,利用该装置可用于高干物质浓度酶水解体系的连续酶水解与发酵。

研究了干物质浓度21%,酶加量5.4%;干物质浓度25%,酶加量4.8%;干物质浓度36.8%,酶加量3.7%共3个体系的连续酶水解发酵过程。干物质浓度21%/酶加量5.4%和干物质浓度25%/酶加量4.8%两个体系分别在27 d和36 d内最终达到稳定运行,乙醇浓度最高分别可达到2.8%和3.3%。干物质浓度36.8%,酶加量3.7%体系由于抑制物的影响无乙醇产生,但最稳定运行时水解糖浓度可达到12.5%,达到了提高酶水解过程水解糖浓度的目的。

与丹麦inbicon公司公开的24% TS连续酶水解体系过程参数进行了对比,其葡萄糖浓度趋势与本研究干物质浓度25%/酶加量4.8%体系葡萄糖浓度趋势相似。

在酵母菌可耐受范围内,连续酶水解过程中产糖和产乙醇浓度随干物质浓度增加而增加。纤维素水解率随停留时间增加而增加。

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Research of the continuous saccharification and ethanol fermentation from pretreated corn stalks

ZHANG Quan,GUAN Hao,CAO Chang-hai,TANG Kai-yu

(Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals,Fushun 113001,China)

A laboratory device for the continuous saccharification and fermentation process(CSF)of high total solid(TS)pretreated corn stalk(PCS)was designed and constructed in this article. The CSF processes of 3 types of system were investigated,in which the total solid were 21%,25% and 36.8%,and cellulase loading(EL)were 5.4%,4.8% and 3.7% respectively. The 21% TS/5.4% EL and 25% TS/4.8% EL systems achieved stable operation within 27 d and 36 d,and in which the highest ethanol concentration came to 2.8% and 3.3% respectively. Due to high inhibitor concentration,the 36.8% TS/3.7% EL system had no ethanol produced,but in which the hydrolyzed sugar concentration came to 12.5%. The purpose of enhancing hydrolysis sugar concentration in enzymatic process was achieved,which indicated that continuous enzymatic hydrolysis and fermentation technology was feasible.

pretreated corn stalk(PCS);continuous saccharification;cellulase;fuel ethanol

2014-07-24

张全(1977-)，男，硕士，高级工程师，研究方向：生物能源, E-mail:zhangquan.fshy@sinopec.com。

中国石化资助科技项目(合同号213082)。

TS213.4

A

1002-0306(2015)15-0161-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.026