黑脉羊肚菌SOD的纯化及特性研究

侯玉艳,吴素蕊,张 丽,赵天瑞,*,邰丽梅

(1.昆明理工大学 云南省食品安全研究院,云南昆明 650500;2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所,云南昆明 650221)

黑脉羊肚菌SOD的纯化及特性研究

侯玉艳1,吴素蕊2,张 丽1,赵天瑞1,*,邰丽梅2

(1.昆明理工大学 云南省食品安全研究院,云南昆明 650500;2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所,云南昆明 650221)

采用热击法和硫酸铵分级沉淀法对所提取的黑脉羊肚菌SOD进行纯化,对纯化后酶的热稳定性、pH稳定性、敏感性及同工酶类型等进行研究。结果表明:热击法最佳热击温度为60 ℃,最佳热击时间为15 min;硫酸铵分级沉淀法最佳盐溶条件是采用40%饱和度硫酸铵,最佳盐析条件是采用85%饱和度硫酸铵;所纯化的SOD表现出良好的热稳定性和pH稳定性,在60 ℃下保存60 min,其酶活保留超过50%,pH适应范围为6～9;Mn2+对羊肚菌SOD有明显的激活作用,Fe2+对其有明显的抑制作用;该SOD能耐受过氧化氢,但对氯仿-乙醇和SDS较为敏感,黑脉羊肚菌SOD属于Mn-SOD类型。

黑脉羊肚菌,超氧化物歧化酶(SOD),纯化,酶学性质

羊肚菌是一类名贵的珍稀食药用菌[1],泛指羊肚菌属的多种真菌[2]。羊肚菌品种较多,主要包括羊肚菌(M.esculenta)、小羊肚菌(M.deliciosa)、高羊肚菌(M.elata)和黑脉羊肚菌(M.angusticeps)等8个种[3]。黑脉羊肚菌营养成分十分丰富,粗蛋白含量为7.87～9.79 g/100 g,粗脂肪含量5.44～6.30 g/100 g,粗纤维含量17.93～24.81 g/100 g,灰分含量8.18～10.17 g/100 g;含有K、Ca、Mg、Fe、Zn等多种人体必需的矿质元素[4-5]。羊肚菌具有抗氧化、增强机体免疫力、保肝护肾、促进胃肠蠕动以及降血压等生物学功能[6-9]。

超氧化物歧化酶(surperoxidedismutase,SOD)是一种生物体内防御氧化损伤的重要抗氧化剂,广泛存在于动物、植物和微生物内,是机体内唯一以超氧阴离子为底物的酶,它能维持细胞内氧自由基处于无害低水平状态[10-11]。目前,国内外关于羊肚菌化学成分研究较多的是氨基酸成分、无机元素以及多糖,而酶类的研究相对较少。本文以黑脉羊肚菌为研究对象,对其子实体中SOD的纯化效果及酶学性质进行考察,旨在为黑脉羊肚菌的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑脉羊肚菌 由昆明食用菌研究所提供;石英砂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、邻苯三酚、无水乙醇、EDTA·Na2均购自天津市津东天正精细化学试剂厂;氯仿、盐酸 均购自重庆川东化工有限公司;过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、NaOH、CaCl2、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、BaCl2、NaCl、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O等其他试剂 均为国产分析纯。

AL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HH-4型恒温水浴锅 市杰瑞尔电器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环多用真空泵 巩义市英峪予华仪器厂;TU1901型双光束紫外可见光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;TGL-16G飞鸽牌冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;79-1数显恒温加热磁力搅拌器 天津市工兴电器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 粗酶液的提取 采用磷酸盐缓冲液提取法。将黑脉羊肚菌子实体打磨成粉过40目筛,准确称取5 g置于研钵中,加入石英砂少许,预冷的150 mmol/L、pH7.8的磷酸钠缓冲液150 mL,然后冰浴研磨匀浆4 h,六层纱布过滤,4 ℃、8000 r/min离心20 min,上清液即为粗酶液。4 ℃保存,待测。

1.2.2 粗酶液的纯化

1.2.2.1 热击法纯化SOD粗酶液 参照张丽[12]等的方法并稍作修改:取五份10 mL粗酶液,分别于50、55、60、65、70 ℃下对其进行加热处理20 min,而后立即放入冰水混合物中冷却20 min,在4 ℃、8000 r/min下冷冻离心20 min,测定上清液酶活力和蛋白质含量。再分别量取三份10 mL体积的粗酶液,将其置于最适热击温度下水浴,分别在10、15、20 min时取出,冷却、离心后,测定酶活力。

1.2.2.2 硫酸铵分级沉淀纯化 参照武金霞[13]等的方法并稍作修改:取六份25 mL经热击法纯化后的粗酶液,缓慢加入(NH4)2SO4使其饱和度分别为30%、35%、40%、45%、50%、55%,置于层析柜中4 ℃下缓慢搅拌3 h,在4 ℃、8000 r/min下离心20 min,取上清液透析后测定酶活力。同样方法,使其饱和度分别为70%、75%、80%、85%、90%、95%时,测定酶活力。

1.2.3 黑脉羊肚菌SOD酶学性质研究

1.2.3.1 温度稳定性 超氧化物歧化酶是一种金属蛋白酶,分子中的金属辅基使其具有短暂的耐热性,为考察SOD的热稳定性,实验量取六份1 mL纯化后的酶液于60 ℃下分别保温30、60、90、120、150、180 min后,以未处理的酶活力作为对照(100%),测定酶活性,重复3次。

1.2.3.2 pH稳定性 溶液pH因改变酶蛋白与金属辅基的结合状态从而影响其活性,为了考察SOD的酸碱稳定性,实验量取十份1 mL的酶液,分别加入pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的缓冲液4 mL,其中pH3.0～5.0为0.1 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,pH6.0～8.0为0.2 mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液,pH9.0～10.0为1/15 mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液,pH11.0～12.0为0.05 mol/L磷酸氢二钠-0.1 mol/L氢氧化钠缓冲液。混合均匀后,置于4 ℃下放置24 h后,以最适pH8.0时的酶活力作为对照(100%),测定酶活性,重复3次。

1.2.3.3 金属离子对SOD活性的影响 在最适条件下,将适量的酶液与金属盐溶液(Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Na+、Cu2+、Zn2+)混合,使金属离子的最终浓度分别为0.001、0.003、0.005、0.01、0.03、0.05、0.1 mol/L,4 ℃下放置3 h,以不加金属离子的SOD的酶活性为100%计,测定酶的残余活力并计算相对活力。

1.2.3.4 SOD的敏感性实验 在2.0 mL酶液中分别加入1.5%的过氧化氢溶液5、10、15、20、25 μL,4 ℃下反应30 min后取样,以未处理的酶活力作为对照(100%),测定酶的残余活力并计算相对活力。在2.0 mL酶液中分别加入2∶3(v/v)氯仿-乙醇溶液10、20、30、40、50 μL,4 ℃下反应30 min后取样,以未处理的酶活力作为对照(100%),测定酶的残余活力并计算相对活力。在2.0 mL酶液中分别加入0.1、0.5、1.0、3.0、5.0 mmol/L的SDS溶液1.0 mL,4 ℃下反应30 min后取样,以未处理的酶活力作为对照(100%),测定酶的残余活力并计算相对活力。

1.2.4 SOD比活力的测定

1.2.4.1 SOD酶活性测定 SOD酶活性测定采用改进的邻苯三酚自氧化法[14]。

邻苯三酚自氧化速率测定:在25 ℃左右,于10 mL离心管中依次加入pH8.0 0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(内含1 mmol/L EDTA·2Na)2.25 mL,蒸馏水2.1 mL,4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液0.15 mL。加入邻苯三酚盐酸溶液后立即混合并倾入比色皿,分别测定在325 nm波长条件下的吸光值,每30 s记录1次OD随时间的变化的值,读取至330 s。计算线性范围内每分钟吸光度值的增加(ΔA),即为邻苯三酚自氧化速率ΔA325/min。

表1 测定蛋白含量标准曲线的试剂用量表

以缓冲液代替酶液做空白。每组实验重复3次。酶活定义为25 ℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD的量为一个活力单位。

1.2.4.2 蛋白含量的测定 标准曲线的制作:取6支试管编号,按表1依次加入试剂。注意:加入碱性硫酸铜溶液后将溶液混匀,室温放置10 min,然后加入Folin-酚试剂,此时要求迅速将溶液混匀。从加入第一管Folin-酚试剂开始计时,计时30 min后于500 nm处比色,测光密度值,用0号管作空白,其余每管重复三次,取平均值。以蛋白质浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线为定量依据。

样品的测定:取1 mL样品溶液,按表2加入碱性硫酸铜溶液和Folin-酚试剂,测定光密度值,具体方法同上。

表2 测定样品中蛋白质含量的试剂用量表

1.2.4.3 SOD的比活力的计算方法 SOD的比活力按下面公式计算:

2 结果与讨论

2.1 SOD粗酶液的纯化

2.1.1 热击法纯化SOD粗酶液

2.1.1.1 热击温度对SOD纯化的影响 由图1可以得出,随着加热温度的升高,黑脉羊肚菌中SOD提取液中的酶活损失率和蛋白去除率均呈上升趋势,说明加热可以去除SOD粗提液中的杂蛋白,同时酶也属于蛋白质,所以温度的上升,酶活性也会相应的有损失。低于60 ℃时,SOD的比活性随着温度的升高呈上升趋势,因大部分蛋白质的变性温度为55 ℃,而SOD对温度具有一定的稳定性,所以当温度升至60 ℃时,酶的比活力达到最大值,而此后随着温度的上升,SOD比活性有所下降,此时酶活损失的幅度大于杂蛋白的去除,说明温度的进一步升高加速了对SOD活性的破坏。因此,选取60 ℃为最佳热击温度。

图1 热击温度对SOD酶纯化效果的影响Fig.1 The effect of heating temperature on SOD purification

2.1.1.2 热击时间对SOD纯化的影响 由图2可以得出,在60 ℃下,随着热处理时间的延长,黑脉羊肚菌提取液中SOD酶活损失率和蛋白去除率均呈上升趋势。在热处理15 min前,SOD的比活力随着热处理时间的延长呈上升趋势,当15 min时,SOD比活力达到最大。热处理时间小于15 min时,纯化效果不理想,虽然酶活损失率较小,但杂蛋白的去除率也不大;热处理时间大于15 min时,蛋白去除率增大的幅度减小了,但酶活损失率增大的幅度反而增大。因此,选取15 min为最佳热击时间。

图2 热击时间对SOD酶纯化效果的影响Fig.2 The effect of heating time on SOD purification

2.1.2 硫酸铵分级沉淀纯化SOD

2.1.2.1 最佳盐溶硫酸铵饱和度 蛋白质是亲水性大分子,在水溶液中有双电层结构,以此来保证分子的溶解度平衡并稳定存在。在蛋白质的水溶液中,加入少量的中性盐,会增加蛋白质分子表面的电荷,增强蛋白质分子与水分子的作用,从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大,这种现象称为盐溶。利用此性质可除去提取液中的不溶性蛋白,达到除杂的目的。由图3可知,选择40%的硫酸铵饱和度进行盐溶。

图3 SOD的盐溶曲线Fig.3 The salt-soluble curve of SOD

2.1.2.2 最佳盐析硫酸铵饱和度 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度,以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐时,高浓度的盐离子有很强的水化力,其对水分子的亲和力大于蛋白质,可夺取蛋白质分子的水化层,即蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失,使之“失水”,从而破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质的溶解度降低而从水溶液中析出,同时,中性盐加入蛋白质溶液后,由于离子强度发生改变,蛋白质表面电荷大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,使蛋白质分子之间聚集而沉淀。由图4可知,选择85%的硫酸铵饱和度进行盐析。

表3 黑脉羊肚菌SOD纯化的结果

表4 金属离子对SOD活性的影响

注:
注:小写字母表示同一浓度下不同种类金属离子对SOD活性的影响,小写字母不同表示差异性显著(p<0.05);大写字母表示同一金属离子不同浓度下对SOD活性的影响,大写字母不同表示差异性显著(p<0.05)。

2.1.3 纯化的结果 将热击法和硫酸铵分级沉淀法对SOD粗酶液纯化的结果比较见表3。

图4 SOD的盐析曲线Fig.4 The salting-out curve of SOD

由表3可知,在最佳提取条件下收集到的粗酶液依次经过热击处理、硫酸铵分级沉淀法对其进行初步纯化,得到的黑脉羊肚菌SOD比活力达306.29 U/mg。

2.2 黑脉羊肚菌SOD酶学性质测定

2.2.1 SOD的热稳定性 由图5看出,60 ℃下随着保温时间的增加,SOD残留相对酶活性逐渐减小,在加热60 min后,酶活仍保留了一半以上,证明SOD的热稳定性较好。

图5 SOD的热稳定性Fig.5 Thermal stability of SOD

2.2.2 SOD的pH稳定性 由图6可以看出,在pH6～9的范围内,SOD的活性损失很少,残留相对活性较高,可以认为SOD对pH的适应范围较宽,是一种对pH比较稳定的酶。

图6 SOD的pH稳定性Fig.6 pH stability of SOD

2.2.3 金属离子对SOD活性的影响 由表4可知,当向反应体系中加入不同的金属离子后,多种金属离子对SOD的酶活性均有一定的影响,并且随着金属离子浓度的不同,作用程度有所不同。Mn2+、Cu2+、Zn2+随着离子浓度的增大,对SOD的激活作用先增大后减小,相对酶活性保持在100%～150%的范围内。而Ba2+、Na+随着离子浓度的增大,对SOD的激活作用逐渐减小,甚至当离子浓度大于0.03 mol·L-1时,对其起到了抑制作用。Mn2+的激活作用最为明显,相对酶活达到了184.1%。而Fe2+则对其具有非常明显的抑制作用,当金属离子浓度达到0.1 mol/L时,检测不到酶活性。

2.2.4 SOD敏感性测定 由图7可知,SOD能耐受过氧化氢,但对氯仿-乙醇和SDS非常敏感,随着溶液加入量的增加,SOD的酶活逐渐降低。当SDS溶液浓度达到5.0 mmol/L时,酶的活性被抑制了65%。根据SOD酶的敏感性实验:Cu、Zn-SOD对H2O2敏感,但能耐受SDS和氯仿-乙醇;Fe-SOD对SDS、H2O2和氯仿-乙醇均较敏感;Mn-SOD对SDS和氯仿-乙醇敏感,但能耐受H2O2[15-16]。由此可以推断黑脉羊肚菌SOD属于Mn-SOD。

图7 SOD的敏感性实验Fig.7 Sensitive experiment of SOD

3 结论

本实验以黑脉羊肚菌子实体为研究对象,研究了SOD的初步纯化方法,并对纯化后SOD酶的热稳定性、pH稳定性及敏感性进行研究,推断出该SOD属Mn-SOD。

热击法纯化中,随着加热温度的升高以及时间的延长,酶活损失率和蛋白去除率均呈上升趋势,酶的比活力先增大后减小。这说明加热能一定程度的去除杂蛋白,但是过高的温度和过长的加热时间也会加速酶活性的损失,因此选取最佳热击温度为60 ℃,热击时间为15 min。硫酸铵分级沉淀法的实验中将硫酸铵饱和度调至40%,发生盐溶现象,此步骤可除去不溶性蛋白,再将硫酸铵饱和度调至85%,此时蛋白质的溶解度降低导致盐析,以此纯化SOD。

稳定性实验结果显示,SOD的热稳定性较好,在60 ℃下加热30 min,酶活性能保留80%左右。在pH6～9的范围内,SOD的活性损失很少,残留相对活性较高,可以认为SOD对pH的适应范围较宽,是一种对pH比较稳定的酶。多种金属离子对SOD的酶活性均有一定的影响,其中Fe2+对其具有非常明显的抑制作用,当Fe2+浓度达到0.1 mol/L时,检测不到酶活性。敏感性实验表明该SOD能耐受过氧化氢,但对氯仿-乙醇和SDS较为敏感,为黑脉羊肚菌SOD类型的推断提供重要依据。

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Purification and characteristics of SOD inMorchellaangusticeps

HOU Yu-yan1,WU Su-rui2,ZHANG Li1,ZHAO Tian-rui1,*,TAI Li-mei2

(1.Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply of Marketing Cooperative,Kunming 650221,China)

SOD inMorchellaangusticepswas purified by heating and ammonium sulfate graded precipitation. Then,the thermal stability,pH stability,sensitivity and isozyme types of SOD were also studied. Results showed that the best temperature and time of heating method was 60 ℃ and 15 min,respectively. The optimum mass fraction of ammonium sulfate for salt-soluble and salting-out were 40% and 85%,respectively. The purified SOD showed good thermal stability and pH stability. SOD retained more than 50% when save 60 min at 60 ℃and the accommodation pH was 6～9. Mn2+could significantly activate purify SOD,while Fe2+remarkably inhibit the activity of SOD. The SOD could tolerate hydrogen peroxide,however,it was sensitive to chloroform-ethanol and SDS. Therefore,this SOD belongs to Mn-SOD type.

Morchellaangusticeps;superoxide dismutase(SOD);purification;enzymatic properties

2014-09-22

侯玉艳(1990-),女,硕士研究生,主要从事食品科学研究,E-mail:493601137@qq.com。

*通讯作者:赵天瑞(1964-),男,本科,副教授,主要从事食品科学与工程研究,E-mail:food363@163.com。

国家科技支撑计划课题(2013BAD16B01)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0147-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.023