三斑海马蛋白肽ACE抑制活性的研究

徐克寒,申铉日,*,陈国华

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.海南大学海洋学院,海南海口 570228)

三斑海马蛋白肽ACE抑制活性的研究

徐克寒1,申铉日1,*,陈国华2

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.海南大学海洋学院,海南海口 570228)

本文通过三斑海马酶解液的制备、ACE抑制活性肽的分离和体外消化模型的建立研究了三斑海马蛋白肽的ACE抑制活性。利用碱性蛋白酶制备得到具有ACE抑制活性的三斑海马酶解液,经葡聚糖凝胶层析分离纯化后,得到具有较高ACE抑制活性的组分(其IC50为0.91 mg/mL);通过对该组分的氨基酸组成和体外消化模型分析,发现该组分中疏水性氨基酸的含量为50.48%,消化酶作用后,显著提高ACE抑制活性,经判断,该组分中的蛋白肽为前体型抑制剂。

三斑海马,ACE抑制,酶解液

海马(Hippocampus)隶属于海龙科,是我国传统的名贵中药材,性温、味甘咸,具有温肾壮阳、散结消肿的功效,可用于治疗阳痿、遗尿、肾虚作喘、症瘕积聚、跌扑损伤及痈肿疔疮[1]。近年来,国内外研究表明,海马活性成分丰富,含有甾体类、蛋白质、脂肪酸类、磷脂类等,其中蛋白质含量高达67.90%～73.56%(干重),并具有温肾壮阳、抗疲劳、延缓衰老、抗肿瘤、抗炎等活性[2-3],应用前景广泛。目前,过度捕捞导致海马濒危,迫切需要更多地了解其独特的生物生理学和药理学特性,以合理利用这一珍贵物种[4]。

高血压已成为世界第一杀手,高血压患者也逐渐出现年轻化,安全、有效地治疗高血压迫在眉睫。血管紧张素转化酶(Angiotensin-I converting enzyme,ACE)为二肽羧基蛋白酶,是人体调节血压过程中尤为重要的一种蛋白酶。在人体肾素-血管紧张素系统中,ACE将不具有生理活性的血管紧张素-Ⅰ转化为血管紧张素-Ⅱ,促使血管收缩、醛固醇分泌以及Na和水的保留,从而升高血压[5];另外,在人体胰舒血管素-激肽系统中,ACE降解舒缓激肽,使其丧失舒张血管的功能,从而升高血压[6]。因此,若能有效的抑制ACE活性,将有利于降低人体血压。目前,已从多种不同的动物及植物体内分离得到ACE抑制肽[7],如三文鱼、金枪鱼、海藻、大豆、奶制品等,但是关于海马ACE抑制活性的研究尚未见报道。

因此,本研究以三斑海马为原料,采用蛋白酶酶解法,并利用葡聚糖凝胶层析进行初步分离,获得具有较高ACE抑制活性的组分,并对该组分进行氨基酸组成分析及体外消化实验,为进一步海马活性研究提供依据及参考,以期提高海马的利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三斑海马干品 广州市天泽贸易有限公司;胰蛋白酶(250 U/mg)、碱性蛋白酶(2000 U/mg)、木瓜蛋白酶(6000 U/mg)、胃蛋白酶(2100 U/mg) 南宁庞博有限公司;ACE、马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)、猪胃蛋白酶(806.3 U/mg protein)、牛胰凝乳蛋白酶(40 U/mg protein)、牛胰蛋白酶(12132 U/mg protein) 美国SIGMA公司;Sephadex G-25 北京瑞达恒辉科技发展有限公司;其他试剂 均为国产分析纯或色谱纯。

旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;HL-2恒流泵 南京普阳科学仪器研究所;HD-5电脑紫外检测仪南京大学;PHS-3C精密pH计 上海精密科学仪器有限公司;TDL-60B低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;FD5512冷冻干燥机 韩国ilShin;电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司;紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;Agilent1100高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 三斑海马酶解液的制备 将三斑海马干品粉碎,称取一定质量三斑海马粉末置于烧杯中。选择碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶四种酶,酶解条件为料液比1∶15(g∶mL)、加酶量1.0%(酶/底物蛋白质,w/w),并按表1的酶解pH和温度下酶解6 h。100 ℃灭酶10 min后,抽滤,收集滤液,并进行离心,取上清液,获得三斑海马酶解液,适当浓缩后冷冻干燥,制得三斑海马酶解液冻干粉,隔光隔氧保存。

表1 四种蛋白酶的酶解条件[8]

1.2.2 ACE抑制率的测定 采用Liu[8]的方法测定ACE抑制率。取30 μL试样、250 μL 5 mmol/L底物HHL溶液(溶于含0.6 mol/L NaCl的硼酸缓冲液,pH 8.3)置于螺口试管中,混匀,于37 ℃水浴5 min后,向螺口试管中加入0.06 U/L ACE溶液(溶于硼酸缓冲液,pH 8.3),混匀,于37 ℃水浴60 min后,加入1 mol/L HCl终止反应,充分混匀后,加入1.5 mL乙酸乙酯萃取反应生成的马尿酸,离心3000 r/min、10 min,移取1 mL上层溶液置于磨口试管中,真空浓缩干燥蒸干乙酸乙酯后,加3 mL蒸馏水置于试管中复溶马尿酸,于228 nm波长处测定吸光度值。ACE抑制率按下列公式计算:

其中,ES-试样组的吸光度值;EC-空白组的吸光度值;EB-加入ACE之前提前加入HCl组的吸光度值。

1.2.3 ACE抑制肽的分离纯化 选择Sephadex G-25凝胶用于分离。凝胶预处理后,填装至2 cm×100 cm的层析柱中,平衡3～4 h,流速调节至1 mL/min,上样(试样溶于蒸馏水,溶度为25 mg/mL,上样量为2 mL),以蒸馏水为洗脱液进行洗脱。检测波长为280 nm,按峰进行收集,多次收集后,将收集液浓缩并冷冻干燥,适当条件下保存。

1.2.4 氨基酸组成分析 对经过Sephadex G-25层析分离得到ACE抑制活性最高的组分进行氨基酸含量分析,按照GB/T22492-2008进行检测。

1.2.5 体外消化实验 采用陈飞平[9]的实验方法,并稍作改进。将经过Sephadex G-25层析分离得到ACE抑制活性最高的组分用蒸馏水配成浓度为2 mg/mL的溶液,用1 mol/L HCl调节pH2,加入1%(w/v)胃蛋白酶,于37 ℃振荡保温2 h,在100 ℃下灭酶5 min,冷却至室温后,5000 r/min离心20 min,取1 mL上清液用于测定ACE抑制率,剩余上清液用1 mol/L NaOH调节pH8.3,加入2%(w/v)胰凝乳蛋白酶,于37 ℃振荡保温2.5 h,在100 ℃下灭酶5 min,冷却至室温后,5000 r/min离心20 min,取1 mL上清液用于测定ACE抑制率,剩余上清液用胰蛋白酶处理,方法同胰凝乳蛋白酶处理方法,完成后取上清液用于测定ACE抑制率。

1.3 统计分析

采用originPro 8软件对数据进行统计分析,两组间的数据比较采用T-检验,p<0.05表示差异有显著意义,p<0.01表示差异有极显著意义。

2 结果与讨论

2.1 三斑海马酶解液ACE抑制肽的制备

蛋白酶的选择对制备活性多肽尤为重要,它的酶切位点会影响多肽的骨架,使酶解液呈现出强弱不同的ACE抑制活性。本研究选取了四种商业用酶,为碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶,分别对三斑海马进行酶解,探讨其酶解液的ACE抑制活性。分别称取一定质量的四种酶解物冻干粉,配置成浓度为1 mg/mL的溶液,测定酶解液的ACE抑制率,实验结果见图1。结果表明,四种酶解液都表现出一定的ACE抑制活性,其中碱性蛋白酶酶解液(SHP)的ACE抑制率最高,为37.75%。通常情况下,ACE抑制肽为短肽,并含有疏水性氨基酸残基[10],而碱性蛋白酶是一种丝氨酸型的内切酶,倾向于形成以疏水性氨基酸为末端的肽[11],并且,碱性蛋白酶能切开蛋白质分子内部肽链-CO-NH-生成分子量较小的多肽。因此,选择碱性蛋白酶酶解液做进一步的分离纯化。

图1 不同酶解液的ACE抑制率Fig.1 ACE-inhibitory activityof the different three-spot hippocampus hydrolysates

2.2 三斑海马ACE抑制肽的分离纯化

ACE抑制肽的理化性质和生物活性主要取决于其分子量大小及氨基酸序列[12]。葡聚糖凝胶层析是依据蛋白质分子量大小进行分离的技术,分子量大的物质先出峰,分子量小的物质后出峰。选取Sephadex G-25对SHP进行分离,获得分子量大小不同的组分。用蒸馏水以1 min/mL的流速进行洗脱,得到如图2的层析谱图。由图2可知,SHP通过Sephadex G-25凝胶分离得到6个峰,分别为SHP1、SHP2、SHP3、SHP4、SHP5和SHP6。

图2 SHP(A)和标准蛋白(B)的葡聚糖凝胶层析谱图Fig.2 Gel filtration chromatography of SHP(A)andprotein marker(B)on a Sephadex G-25 column

按峰收集,分别测定浓度为1 mg/mL收集液的ACE抑制率。从图3显示的结果可知,组分SHP5的ACE抑制率最高,为57.45%,IC50为0.91 mg/mL。经Sephadex G-25凝胶分离的SHP5与SHP相比,ACE抑制率明显提高。将SHP葡聚糖凝胶层析谱图与标准蛋白谱图进行对比,可以判断SHP5的分子量小于1000 u,与大多ACE抑制肽的分子量小于1500 u[13]的研究成果相符。

图3 SHP葡聚糖凝胶分离各组分的ACE抑制率Fig.3 ACE-inhibitory activity of thefractions on gel filtration chromatography

2.3 氨基酸组成分析

ACE抑制肽通常含有疏水性氨基酸残基,并且ACE抑制肽C端的三个氨基酸序列会影响多肽与结合ACE的能力,若该位置含有疏水性氨基酸,则该肽极有可能具有较高的ACE抑制活性[14];也有研究者发现ACE抑制肽C端氨基酸为芳香族氨基酸或脯氨酸,或N端为疏水性氨基酸(除脯氨酸)时,ACE抑制肽活性较强[15]。从表2可知,SHP5的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸分别占总氨基酸含量的50.48%、7.78%,与A. Alemán[16]从乌贼皮胶原蛋白分离得到ACE抑制活性最高的组分(分子量小于1000 u)的疏水性氨基酸含量为54.6%的结果近似。组分SHP5中丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸和缬氨酸的含量较高。目前,诸多研究发现ACE抑制肽中含有丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸,如海蜇(IGDEPLANYL)[17]、海参(MEGAQEAQGD)[18]及海虾(IFVPAF)[19]等。但氨基酸序列对ACE抑制活性的影响较大,需要更深入的研究。

表2 SHP5的氨基酸组成分析

2.4 体外消化实验

体外消化实验是通过模拟人体胃肠道消化,考察物质能否抗消化酶的消化。对SHP5进行体外消化模拟实验,依次采用胃蛋白酶(P)、胰凝乳蛋白酶(C)和胰蛋白酶(T)酶解,每步测定消化液的ACE抑制率。从图4可知,在体外消化模拟实验中,SHP5经胃蛋白酶消化后,ACE抑制率显著提高,从55.48%提高至76.65%;再经胰凝乳蛋白酶消化后,ACE抑制率再次提高,提高至93.75%;最后经胰蛋白酶消化后,ACE抑制率基本不变,为93.24%。实验结果表明,该组分经消化后ACE抑制活性显著提高,抑制率提高了37.76%,表明SHP5为前体型抑制剂,口服后在人体内具有降低血压的活性。

图4 SHP5消化酶处理后的ACE抑制率Fig.4 ACE-inhibitory activity ofcomponent SHP5 treated by digestive enzyme注:与SHP5相比较,**表示差异显著(p<0.05)。

3 结论

本研究对三斑海马的降血压活性进行探讨,发现三斑海马碱性蛋白酶酶解液具有较高的ACE抑制活性。该酶解液经葡聚糖凝胶层析分离后,分离组分SHP5(分子量<1 ku)的ACE抑制率最高,IC50为0.91 mg/mL。实验结果还表明,该分离组分中疏水性氨基酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和亮氨酸含量较高,且其经消化酶作用后ACE抑制活性显著提高。今后,有待于对该分离组分的消化液进行深入的分析研究。

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Angiotensin I-converting enzyme(ACE)inhibitory activity of enzymatic hydrolysate from three-spothippocampus

XU Ke-han1,SHEN Xuan-ri1,*,CHEN Guo-hua2

(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China;2.College of Ocean,Hainan University,Haikou 570228,China)

In this paper,the ACE-inhibitory activity of three-spothippocampuspeptides were evaluated by studying the preparation technique of three-spothippocampusenzymatic hydrolysate,screening chromatography separation of ACE-inhibitory peptides and establishing the model. The enzymatic hydrolysate with ACE-inhibitory activity was prepared by alkaline protease,and then separated and purified by gel filtration chromatography. After determination,the lower molecular fraction exerted the highest ACE-inhibitory activity(IC50was 0.91 mg/mL). The composition of amino acids in it was analyzed,and the test result indicated that the content of hydrophobic amino acids was 50.48%. In addition,it was suggested that the ACE-inhibitory peptides acted as ‘prodrug-type’ inhibitor after establishing the model of artificial gastrointestinal digestion. ACE-inhibitory activity was increased significantly under condition of digestive enzyme digestion.

three-spothippocampus;ACE-inhibitory activity;hydrolysate

2014-11-05

徐克寒(1990-),女,硕士研究生,研究方向：水产品加工,E-mail:793874992@qq.com。

*通讯作者:申铉日(1968-),男,博士,教授,研究方向：海洋生物资源利用、食品科学,E-mail:shenxuanri2009@163.com。

十二五国家科技支撑计划课题(2013BAB01B04)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)15-0096-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.012