獐奶氨基酸和脂肪酸含量分析及奶胃微生物分离鉴定

赵国忠,胡陆军,王金美,姚云平,郝光飞,陈 卫,*

(1.江南大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122;2.无锡市动物园管理处,江苏无锡 214086)

獐奶氨基酸和脂肪酸含量分析及奶胃微生物分离鉴定

赵国忠1,胡陆军1,王金美2,姚云平1,郝光飞1,陈 卫1,*

(1.江南大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122;2.无锡市动物园管理处,江苏无锡 214086)

獐奶是幼獐的奶胃形成獐宝的基本物质,獐的奶胃是形成獐宝的主要场所。为进一步研究獐宝的体外合成机制,本文采用高效液相色谱和气相色谱法测定了獐奶中氨基酸和脂肪酸含量。并通过传统微生物分离手段对獐的奶胃微生物进行了分离鉴定。通过测定发现,獐奶中的水解氨基酸含量是牛奶的2.73倍。獐奶中丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸等游离氨基酸的含量高于牛奶中的含量,谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸的含量却低于牛奶中的含量。獐奶中硬脂酸和亚油酸含量为牛奶的2倍多。通过对獐的奶胃微生物的分离和16S rDNA手段鉴定获得20种细菌,这些细菌主要为动物类乳杆菌、肠杆菌和肠球菌类,这些细菌对促进“獐宝”形成起一定的作用。

獐,氨基酸,脂肪酸,细菌

獐为鹿科动物,分布于中国长江沿岸和朝鲜,文献中记载的地点多为江苏省无锡、镇江及苏州。獐,无角,成年獐体长约1米,四肢粗壮发达,耳朵相对较大,尾巴很短,毛多为棕黄色、灰黄色,毛粗而且脆,上犬齿发达,雄性獐齿尤其长而且大,约5 cm。獐生性胆小,动作灵敏,受惊扰时狂奔如兔。獐浑身是宝,幼獐吮吸獐奶后在胃中凝结而成的乳白色奶块,俗称“獐宝”,是一种名贵药材,具有增加胃液分泌量和促进胃蛋白酶排出的作用,主治小儿疳积等消化不良症状。对促进儿童发育、提高智力和补益身体有较好作用,对中老年有提高抵抗力之功效。獐宝中免疫蛋白质含量约40%,含有多种微量元素[1],17种氨基酸含量占39.6%,谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸和赖氨酸含量尤其高。动物实验也发现,獐宝对于提高鼠胃蛋白酶的活力,提高鼠血清胃泌素含量及小肠蠕动有很好的作用[2-4]。

獐属于国家二级保护野生动物。目前,国内已经建立了许多专门饲养獐的基地,靠人工养殖,科学的“活体取宝”,既保护了物种,又能保证獐宝的质量,大大提高了獐宝的产量[5]。獐宝由獐乳而来,但是獐乳却没有獐宝的功效。獐乳经过小獐奶胃各种消化酶及微生物的作用以后,即赋予如此功效,可见小獐奶胃中的微生物起着至关重要的作用[6]。如果能实现小獐奶胃微生物的体外培养,在体外条件下实现獐宝的合成,那么对于减轻獐痛苦和提高獐宝产量将会有巨大的作用。本文对獐乳的氨基酸和脂肪酸含量进行了比较分析,并且对獐奶胃微生物进行了筛选鉴定,为獐宝形成的理论研究提供了科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

獐奶 采自无锡市阳山镇;牛奶 购于无锡天姿乳业。

配置培养基、脂肪酸提取所用试剂 均为市售分析纯;17种氨基酸标品和脂肪酸标品 均为色谱纯;Taq酶、三磷酸脱氧核糖核苷(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTP) 购自Tiangen公司。

氨基酸专用高效液相色谱仪 美国Agilent公司;GC气相色谱仪 日本岛津公司;BX51光学显微镜 日本OLYMPUS公司;琼脂糖凝胶电泳仪 美国Bio-Rad公司;电泳槽 北京市六一仪器厂;凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 氨基酸分析样品处理 游离氨基酸:取獐乳1 mL 10%三氯乙酸等体积混合,放置1 h,用双层滤纸过滤,取滤液1 mL于1.5 mL离心管中,10000 r/min离心10 min后取上清液500 μL于Agilent专用样品瓶内,备用[7]。

水解氨基酸:称样(准确称取1.0 g样品放入水解管中),然后水解(加入1 mL浓盐酸和6 mL的4 mol/L盐酸,边抽真空边封管,封好后的水解管统一放入设定温度为110 ℃的烘箱,水解22 h),定容(水解液用25 mL容量瓶定容,然后用两层滤纸过滤,去滤液1 mL于25 mL小烧杯中,放入真空干燥器中过夜干燥),蒸酸、取样(取出蒸干后的小烧杯,加入0.02 mol/L盐酸,静置1 h后,用玻璃棒搅拌后直接倒入1.5 mL离心管内,10000 r/min离心10 min后取上清液500 μL于Agilent专用样品瓶内,备用)[8]。

1.2.2 氨基酸分析 色谱柱:(250 mm×4.6 mm),5 μm ODS HYPERSIL;柱温:40 ℃;流动相:A相:称取8.0 g结晶乙酸钠于1000 mL烧杯中,加入1000 mL水搅拌至溶解,再加入225 μL三乙胺,搅拌并滴加5%醋酸,将pH调到7.20±0.05,加入5 mL四氢呋喃,混合后备用;B相:称取8.0 g结晶乙酸钠于800 mL烧杯中,加入400 mL水搅拌至溶解,滴加2%醋酸,将pH调到7.20±0.05,将此溶液加入800 mL乙腈和800 mL甲醇混合备用[7]。

1.2.3 脂肪酸提取 取1 mL样品于瓶1中,加入50 μL C17∶0的内标,加入1 mL 10%的HCl-甲醇溶液、0.5 mL正己烷,振荡混匀,60 ℃,3 h,期间每隔0.5 h振荡一次。然后,加入1 mL正己烷,1 mL饱和NaCl,振荡混匀,3000 r/min离心3 min,取上清液于瓶2中。重复上一步,向瓶1中加入1 mL正己烷,1 mL饱和NaCl,振荡混匀,3000 r/min离心3 min,取上清液于瓶2中。然后N2吹干,加入1 mL正己烷溶解,备用[9]。

1.2.4 脂肪酸分析 用气相色谱进样针吸取20 μL提取的脂肪酸样品,采用岛津公司的气相色谱仪AOC-20i测定,色谱柱条件:DB-WAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm;美国Agilent公司);氢火焰离子(FID)检测器检测;选用氮气为载气,流量为2 mL/min,采用分流方式进样1 μL,分流比15∶1,进样口温度为240 ℃;升温程序:120 ℃保持30 min,以5 ℃/min升至190 ℃,再以1 ℃/min升到210 ℃,保持3 min[9]。

1.2.5 微生物分离 用100 mL生理盐水清洗獐的奶胃,收集清洗液作为样品。取10 mL样品作为原液,分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度溶液。将每个稀释度溶液各以100 μL平均点加入到MRS平板和PDA平板上面,小心地用灭过菌的涂布器涂干。倒置于37 ℃和30 ℃恒温培养箱中,15～24 h以后取出观察,记录长出的单菌落的不同形态,并用无菌牙签挑出单一菌落的菌株,镜检,三区划线反复3次,37 ℃和30 ℃恒温过夜培养,并对其进行革兰氏染色镜检。镜检以后的菌株分别接种于MRS或PDA液体管中进行传代培养,甘油管保存于-80 ℃冰箱,备用。

1.2.6 微生物鉴定 采用16S rDNA序列比对的方法,先将甘油管保存菌株过夜培养活化2次,离心收集菌体物质。提取该菌株的基因组DNA或直接采用菌落PCR测定。本实验的16Sr DNA的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的引物是采用通用引物序列:上游引物27F的序列为:5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′,下游引物1492R的序列为:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。按照PCR说明书的步骤进行PCR。该反应体系为50 μL:10×buffer 5 μL;dNTPs 5 μL;上游引物(10μmol/L)0.5 μL;下游引物(10 μmol/L)0.5 μL;模板DNA 1.5 μL;dd H2O 37 μL;Taq DNA聚合酶(250 U)0.5 μL。PCR扩增条件为:95 ℃ 5 min;然后95 ℃ 10s;55 ℃ 30s;72 ℃ 1 min,进行25个循环,最后72 ℃延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳检测其产物纯度,条带大小为1500 bp左右。送上海桑尼公司测序,测序结果在NCBI上的Blast功能模块进行物种比对,找出与其相似度最高的种属[10]。

2 结果与分析

2.1 牛奶与獐奶氨基酸含量的比较

表1 牛奶与獐奶氨基酸含量

游离氨基酸能赋予奶类“鲜”的特点,使其味道更加诱人,直接影响其品质。本文通过测定牛奶与獐奶中的游离氨基酸的量,发现獐奶中游离氨基酸总量比牛奶中的少,谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸含量都较低(表1)。谷氨酸和天冬氨酸具有鲜味,是最主要的鲜味氨基酸。甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸能赋予甜味,是主要的甜味氨基酸[11]。獐奶中游离的丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸都比牛奶中的高出很多。其中半胱氨酸是牛奶中的8倍多。丝氨酸为牛奶苏氨酸具有一种焦糖的风味[12],半胱氨酸为一种含硫氨基酸,具有可口的肉香[12]。游离氨基酸不仅能直接赋予食品以滋味,而且它也是其它风味物质的前体物质,氨基酸代谢形成的物质可以与脂类等物质进行反应。

通过对水解氨基酸的测定,不仅能检测奶中蛋白质含量的多少,而且也能了解各种氨基酸所占的比例。獐奶总的水解氨基酸含量是牛奶的2.73倍,并且几乎各种氨基酸含量都是牛奶的2倍以上(表1)。獐奶中氨基酸含量比牛奶高许多,可见其营养价值很高。

2.2 牛奶与獐奶脂肪酸含量的比较

脂类具有重要的代谢生理功能,脂肪酸是人体必需的一种营养素。脂肪酸可以促进细胞膜的形成,组成细胞重要的结构单元,同时它也是构成机体重要的信号物质以及能量的来源之一[13]。脂肪酸的测定以C17∶0作为内标,气相色谱检测后发现,牛奶(图1)和獐奶(图2)中硬脂酸和亚油酸的含量差别最大。经过比较发现,牛奶中硬脂酸(C18∶0)含量为90.93 μg/mL,亚油酸(C18∶2)含量为77.43 μg/mL。獐奶中硬脂酸含量为193.96 μg/mL,亚油酸含量为168.82 μg/mL,硬脂酸和亚油酸含量都为牛奶的2倍多。亚油酸为多不饱和脂肪酸,是一种人体所必需的脂肪酸,对于降低胆固醇和预防心肌梗塞具有一定作用[14]。

图1 牛奶中脂肪酸色谱图Fig.1 Chromatogram of fatty acids in milk注：1.硬脂酸(C18∶0);2.亚油酸(C18∶2)，同2同。

图2 獐奶中脂肪酸色谱图Fig.2 Chromatogram of fatty acidin the Hydropotesinermis milk

2.3 幼獐奶胃微生物的分离

表2 菌株序列比对结果

獐有两个胃,一个草胃,另一个为奶胃(图3)。奶胃在幼獐吃奶时期起重要作用,奶胃依靠大量的微生物及消化酶作用于獐奶,是獐宝形成的重要场所。MRS培养基和PDA培养基上生长的菌落圆润光滑,大小不一(图4)。镜检观察发现有一部分菌为杆状,革兰氏染色成紫色的菌有可能为乳酸菌,还有一些菌成球形,这些菌的菌落都不大,可以初步推断为细菌。PDA平板上生长的菌落也不大,光滑成圆形,也为细菌。

图3 獐草胃和奶胃Fig.3 Grass stomach and milk stomach of Hydropotesinermis

图4 Hydropotesinermis swinhoe微生物在MRS培养基和PDA培养基的菌落形态Fig.4 The colonial morphology onMRS medium and PDA medium

2.4 幼獐奶胃微生物的鉴定

挑选各个形态大小不同的白色菌落在MRS平板和PDA平板上三区划线。连续划线3次,尽可能保证所挑取的菌落为单一微生物。提取DNA后,扩增该细菌的16S rDNA,测序验证后与NCBI数据库比对,序列相似度均大于99%,得到结果如表2所示。从表中可以得出,乳杆菌和一些球菌种类最多,这些乳杆菌从命名来看都属于动物来源,有别于植物乳杆菌。乳杆菌的存在不仅能抑制有害菌的生长,产生多种抑菌物质[15],而且可以产生消化酶,促进獐宝的形成。肠球菌和肠杆菌在獐奶胃中数量也较多。在獐宝形成的过程中也起到一定的作用。

3 结论

本文对獐奶和牛奶中的游离氨基酸、水解氨基酸及脂肪酸含量进行了比较分析。比较发现,獐奶中的游离氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸)含量大于牛奶中游离氨基酸含量的2倍。其中半胱氨酸含量高达2.37×10-4mg/mL,与牛奶中的游离氨基酸形成鲜明对比,是牛奶中的8.66倍。水解氨基酸各个氨基酸含量都超过牛奶中的含量,总氨基酸含量为牛奶中的2.73倍。另外,獐奶中的硬脂酸和亚油酸含量为牛奶中的2倍多,增加比较明显。这些数据都说明獐奶中的营养成分物质要高于牛奶。此外,经过对獐奶胃中微生物的分离鉴定,我们获得了20种来源的微生物。其中,动物类的乳杆菌占大多数,另外还有肠杆菌,肠球菌等细菌,在獐宝形成的过程中提供了独特的胃酸环境,其分泌的代谢产物有效促进了獐宝的形成。本文的研究,为尽快实现獐宝的体外合成创造了条件。

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Analysis of amino acid and fatty acid in theHydropotesinermismilk and identification of the microorganism in the milk stomach

ZHAO Guo-zhong1,HU Lu-jun1,WANG Jin-mei2,YAO Yun-ping1,HAO Guang-fei1,CHEN Wei1,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Zoo Management Office of Wuxi,Wuxi 214086,China)

Hydropotesinermismilk can be synthesized toHydropotesinermisswinhoe in theHydropotesinermismilk stomach. In this study,the contents of amino acid and fatty acid in milk andHydropotesinermismilk were investigated and compared by high performance liquid chromatography and gas chromatography,and the microorganism in theHydropotesinermismilk stomach were also separated for exploring the synthesis mechanism ofHydropotesinermisswinhoe. The content of hydrolysis amino acid inHydropotesinermismilk was 2.73 times more than milk. The contents of free amino acids(serine,threonine and cysteine)inHydropotesinermismilk were more,but the free amino acids(glutamic acid,aspartic acid,glycine and alanine)were less than milk. The contents of stearic acid and linoleic acid inHydropotesinermismilk were 2 times more than milk. In addition,20 kinds of bacterium including animalLactobacillus,EnterobacterandEnterococcuswhich play roles in the formation ofHydropotesinermisswinhoe were separated and indentified by 16S rDNA blasting.

Hydropotesinermis;amino acid;fatty acid;bacterium

2014-09-22

赵国忠(1983-)，男，博士研究生，讲师，研究方向：食品微生物学，E-mail:zgzjiangnan@163.com。

*通讯作者:陈卫(1966-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

国家自然科学基金青年基金项目(31401682)；江南大学2013年校级本科教育教学改革研究立项项目(JGB2013071)。

TS252.54

A

1002-0306(2015)15-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.007