奶牛乳腺上皮细胞的分离培养

高瑞峰 施月桃

(长春科技学院,吉林长春 130600)

奶牛乳腺上皮细胞的分离培养

高瑞峰 施月桃

(长春科技学院,吉林长春 130600)

从荷斯坦奶牛乳房无菌采取乳腺组织,以组织块培养法,建立成熟的奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系,观测长出的上皮细胞在各生长时期的形态变化,纯化奶牛乳腺上皮细胞。结果表明:组织块接种可以得到大量细胞用于原代培养,从而可以进行后期的体外实验。

乳腺上皮细胞;分离;组织块培养

1 材料

1.1 奶牛乳腺组织来源

奶牛乳腺组织块采自健康的泌乳期荷斯坦奶牛（来源于长春市皓月屠宰场）。用无菌手术剪剪取乳腺组织，置于 37℃生理盐水中保存备用。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM/F12、胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin，1：250）、青霉素100 IU/ml、链霉素100 IU/ml，生化培养箱，光学显微镜，激光共聚焦显微镜（奥林巴斯）等。

2 方法

2.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养

2.1.1 奶牛乳腺组织培养前的处理

（1）一部分乳腺组织用4% 甲醛溶液固定；另一部分乳腺组织用于乳腺上皮细胞的分离培养。

（2）用37℃生理盐水将用于细胞分离培养的乳腺组织洗涤数次，直至清除组织中所有的血迹、乳汁及其他杂质。

（3）在无菌操作台中，先用无菌的手术剪将乳腺组织周围脂肪和结缔组织去除，使乳腺腺泡暴露出来。

（4）将获得的腺泡组织在75% 酒精中浸润约 1min，再用0.01M PBS（含有100IU青霉素和100IU链霉素）洗涤 3 次。

（5）将腺泡组织置于无菌的青霉素小瓶中，用无菌的小眼科剪将其剪切成约 1mm3大小的组织块，备用。

2.1.2 奶牛乳腺上皮细胞组织块培养法

（1）将上述剪切完全的乳腺组织块用牙科探针平铺于体积为50ml 的卡氏细胞培养瓶中，植块间距为 0.5cm，应尽量使乳腺组织块的切面向下粘附于细胞培养瓶壁上。

（2）经细胞培养瓶侧壁缓慢加入 5ml DMEM/F-12（含10%FBS）细胞培养液，盖紧瓶盖。

（3）将有组织块的一面朝上，37℃培养箱中静置 2～3h 后，使组织块微干。

（4）将卡氏细胞培养瓶翻转过来，使组织块完全浸没于细胞培养液中，每3d 更换一次新鲜的细胞培养液，待细胞密度为90%时，无菌条件下用牙科探针将组织块完全去除，冲洗换液。

2.2 奶牛乳腺上皮细胞的形态学观察

奶牛乳腺上皮细胞37℃ 培养24h后，在光学显微镜下观察乳腺上皮细胞形态学并照相。

3 结果

奶牛乳腺上皮细胞在24～48h内贴壁，其形态由圆形逐渐呈多角形，具有典型上皮细胞形态。37℃培养72h后，细胞铺满培养板，呈单层铺路石状，如下图。

奶牛乳腺上皮形态学观察

[1] 丁月云，张莉莉，陈莎莎，等.组织块种植法体外培养奶牛乳腺上皮细胞[J].南京农业大学学报，2008，3l（4）：91-96.

[2] 王治国，王传蓉，王加启.不同方法分离奶牛乳腺上皮细胞体外培养的研究[J].乳业科学与技术，2009，（1）：35-38.

[3] Kadegowda AK，Bionaz M，Piperova L S，et a1.Peroxi—some proliferator··activated receptor··gamma activationand long·chain fatty acids alter lipogenie genenetworksin bovine mammary epithelial cells to various extents[J].J Dairy Sci，2009，92（9）：76-89.

[4] 陈建晖，佟慧丽，李庆章，等.奶牛乳腺上皮细胞系的建立[J].畜牧兽医学报，2009，40（5）：743-747.

[5] 崔立莉.奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系的建立及其应用[D].新疆农业大学，2006.