茶多酚抗金黄色葡萄球菌alpha溶血素和肠毒素A和B活性影响研究

李勇辉

(辽宁省锦州市义县稍户营子小荒地牧场,辽宁义县 121100)

茶多酚抗金黄色葡萄球菌alpha溶血素和肠毒素A和B活性影响研究

李勇辉

(辽宁省锦州市义县稍户营子小荒地牧场,辽宁义县 121100)

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,简称金葡菌)是引起食物中毒的主要病原菌之一。也是能引起严重危害人类健康的一类人兽共患传染病的病原,近年在我国的流行呈愈演愈烈的态势,而且由于其不可控制的流行性和不断发展的耐药性,开发新的药物或治疗方法显得尤为重要。本研究是在原有的药物和治疗方法下考察了茶多酚针对食源性病原菌金黄色葡萄球菌在浮游态与生物被膜态的条件下,研究茶多酚对金黄色葡萄球菌浮游菌alpha溶血素和肠毒素A和B活性影响研究成及茶多酚针对食源性病相关基因的影响。

茶多酚;金黄色葡萄球菌

1 金黄色葡萄球菌

1.1 金黄色葡萄球菌的危害

金黄色葡萄球菌在浮游态与生物被膜态的条件下，研究茶多酚对金黄色葡萄球菌浮游菌生物被膜合成及相关基因的影响。方法倍比稀释法测定茶多酚对金黄色葡萄球菌浮游菌的最小抑菌浓度（MIC），对羟基联苯溶液显色法测定茶多酚干扰金黄色葡萄球菌浮游菌生物被膜生长过程中藻酸盐的产生量；扫描电镜观察肠毒素和溶血；荧光显微镜下观察膜分散后死活细菌。目前茶多酚有片剂、注射液等剂型，近年人们对茶多酚进行了广泛深入的研究，其临床应用范围不断扩大，因此，本实验研制茶多酚的Western Blot，改变给药途径，方便更广大的患者，提高患者用药的安全性。

1.2 金黄色葡萄球菌的致病机理

金黄色葡萄球菌有原发性和继发性之分。人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。无论病理变化如复杂何复杂，它只标志着渗出与增生病变之间的量的区别，其实质则是机体在不同部位、不同器官所呈现的不同程度的干酪样坏死和肉芽肿性变化。金黄色葡萄球菌病理变化发生的特点有两个：①原发一病灶不一定出现在原始的门户；②病灶内明显出现肉芽肿变化，在金黄色葡萄球菌灶内有大量体细胞增生，构成特殊性乳业。奶牛的牛金黄色葡萄球菌潜伏期长短不一，短者十几天。

1.3 金黄色葡萄球菌易发生耐药性

近年来世界各地金黄色葡萄球菌的多耐菌株逐渐增多，甚至引起暴发流行。金黄色葡萄球菌的耐药可由自发突变产生（原发性耐药）或由用药不当经突变选择产生（继发性耐药）。但多耐的产生主要可能由于后者。耐药基因在染色体上，对不同药物的耐药不相连接基因，所以用药治疗有效。

2 实验测定

2.1 材料和方法

材料：患金黄色葡萄球菌乳房炎的奶牛乳汁，发霉的食物，一抗和二抗。电泳液相关溶液的配制

（1）1.5M的Tris（PH8.8）：18.17g+100ml（五蒸水）。

（2）1.0M的Tris（PH6.8）：12.11g+100ml（五蒸水），用HCl调pH至6.8。

（3）30%丙烯酰胺的混合液（100ml），取29g丙烯酰胺和1gbis丙烯酰胺用水定容到100ml过滤（0.22um），4℃保存1个月。

（4）2X样品缓冲液（10ml）：甘油2ml、溴酚蓝0.0202g、1MTris（ph6.8）1ml、硫基乙醇0.4ml、10%的SDS4ml。

（5）10%的分离胶（5ml）：五蒸水1.9ml、4℃的30%Acrylovmidemix1.7ml、室温1.5MTris（PH8.8）1.3ml、室温10%SDS（100gSDS定容至1L）0.05ml、4℃的APS（过硫酸铵）0.05ml、4℃TEMED（四甲基二乙胺）0.002ml。

（6）12%的分离胶（5ml）：五蒸水1.6ml、4℃的30%Acrylovmidemix2.0ml、室温1.5MTris（PH8.8）1.3ml、室温10%SDS（100gSDS定容至1L）0.05ml、4℃的APS（过硫酸铵）0.05ml、4℃TEMED（四甲基二乙胺）0.002ml。

（7）浓缩胶（3 m l）：五蒸水2.1 m l、4℃的3 0%Acrylovmidemix0.5ml、室温1.0MTris（PH6.8）0.38ml、室温10%SDS（100gSDS定容至1L）0.03ml、4℃的APS（过硫酸铵）0.03ml、4℃TEMED（四甲基二乙胺）0.003ml。

方法：通过westernblot的方法测定茶多酚抗金黄色葡萄球菌最适宜的浓度，并测定茶多酚用药的最小浓度（MIC）。

2.2 茶多酚抗金黄色葡萄球菌的肠毒素浓度的测定

通过比较分析获取有用的知识和信息是生物学常用的方法，而序列分析最常用的比较方法就是序列比对，将未知序列同整个数据库中的已知序列进行比较分析已经成为分子生物学领域中一个强有力的研究手段。通过序列比对，人们能够判断出两个序列之间是否具有足够的相似性，进而判断两者之间是否具有同源性，通过同源性可以推断两个基因在进化上是否有共同祖先的结论。通过访问NCBI主页进行Blast同源性比对是常用的分析方法，然而在很多场合需要在脱机状态下使用Blast进行同源性比对，另外，公共数据库的比对由于缺乏针对性，使得比对结果复杂，不利于分析。所以，Blast本地化对科研工作的开展是十分有意义的。本数据库的建立为本地化Blast打下了前期基础，为实验室进行乳房炎病毒分子流行病学的研究提供了一个有力的工具。

3 结论

茶多酚抗金黄色葡萄球菌alpha溶血素和肠毒素A和B活性影响研究

实验结果

（1）茶多酚对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）为64µg/ml。

（2）茶多酚对金黄色葡萄球菌alpha溶血素抑制westernblot分析结果：

从左到右依次为：空白，8µg/ml，16µg/ml，32µg/ml。

（3）茶多酚对金黄色葡萄球菌肠毒素A抑制westernblot分析结果：

从左到右依次为：空白，8µg/ml，16µg/ml，32µg/ml。

（4）茶多酚对金黄色葡萄球菌肠毒素B抑制westernblot分析结果：

从左到右依次为：空白，8µg/ml，16µg/ml，32µg/ml。

从以上结果我们可以得到：

①茶多酚对金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性；

②8µg/ml茶多酚能显著抑制金黄色葡萄球菌alpha溶血素活性；

③8µg/ml茶多酚能显著抑制金黄色葡萄球菌肠毒素A活性；

④32µg/ml茶多酚能显著抑制金黄色葡萄球菌肠毒素B活性

以上结果提示：茶多酚可以作为抗金黄色葡萄球菌毒素的潜在药物进行探索。

[1]王晓红.桃柁酚对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响及其分子机制研究[D].西北农林科技大学，2012.