烟草PGIP基因在枯草芽孢杆菌中的表达

江翱 吴辉 袁梦思 孙文秀

摘要：根据GenBank数据库报道的林烟草（Nicotiana sylvestris）PGIP基因cDNA序列，设计特异性引物，从普通烟草（Nicotiana tabacum）种植品种小黄金中分离得到了其gDNA序列，分析结果发现烟草PGIP基因没有内含子序列。信号肽分析结果表明，烟草PGIP基因含有一段长28个氨基酸的信号肽。将去除信号肽的烟草PGIP基因片段亚克隆至枯草芽孢杆菌表达载体pHT43中，转化枯草芽孢杆菌菌株WB600并进行IPTG诱导。SDS-PAGE电泳表明，重组菌株可成功表达目的蛋白质，分子质量符合预期大小；琼脂扩散试验结果发现，表达的烟草PGIP蛋白质能够明显抑制辣椒疫霉PGs的活性。

关键词：烟草（Nicotiana tabacum）；多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白质（PGIPs）基因；枯草芽孢杆菌；表达

中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2767-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.055

Recombinant Expression of Tobacco PGIP Gene in Bacillus subtilis

JIANG Ao， WU Hui， YUAN Meng-si， SUN Wen-xiu

（College of Life Sciences， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China）

Abstract： The Nicotiana tabacum PGIP gDNA from the cultivar “xiaohuangjin” was cloned basing on one PGIP gene from the Nicotiana sylvestris. Sequence analysis showed that the gDNA of tobacco PGIP was identied to the cDNA sequence， with no introns. The tobacco PGIP gene was submitted to a online program for searching the signal peptide sequence. The results showed that the tobacco PGIP gene had a 28 amino acids signal sequence. Subsequently， the mature peptide sequence was subcloned into pHT43 expression vector and transferred into Bacillus subtilis WB600. After induced using IPTG， SDS-PAGE analysis showed that the recombinant protein expressed successfully with the expected molecular weight. Then the activity of the recombinant protein was determined by using AGAR double diffusion experiments. The results indicated that the recombinant PGIP of tobacco could inhibit the activity of PGs from Phytophthora capsici obviously.

Key words：tobacco（Nicotiana tabacum）；polygalacturonase-inhibiting proteins（PGIPs）gene；Bacillus subtilis；recombinant expression

植物细胞壁是对抗真菌入侵的第一道物理屏障。在真菌侵染植物的早期，病原菌通过分泌一系列内源性多聚半乳糖醛酸酶（Endo-PGs）来降解细胞壁组分给其他水解酶降解细胞组织提供便利条件，从而使其很容易在植物细胞中定殖并获取营养[1]，因此，Endo-PGs被认为是植物病原的重要致病因子[2]。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白质（PGIPs）是由植物细胞壁产生的用来降解Endo-PGs的一类糖蛋白质，它们会通过抑制PGs的活性，促进细胞内链寡聚半乳糖醛酸（OGs）的积累，从而激活植物天然免疫系统[3]。单子叶植物和双子叶植物细胞壁中都广泛存在有PGIPs，它们只对病原物产生的PGs起作用，而对植物本身和病原物产生的其他果胶酶无效[2]。不同植物的PGIPs具有相似的结构和序列特征，但与不同病原真菌PGs特异识别的能力却存在很大差异[4]。这就提示，十分有必要开展PGIPs新成员分离和鉴定的研究。目前国内外已报道了大豆[5]、梨[6]、苹果[7，8]、棉花[9]、桃[10]、大白菜[11]、草莓[12]、油菜[13]、甜瓜[14]、水茄[15]和辣椒[16]等多种经济作物的PGIP基因分离和功能的研究。目前尚未见普通烟草（Nicotiana tabacum）种植品种PGIP基因的克隆及功能研究的报道。

研究表明PGIP在植物抗真菌病害的实践中具有重要作用。不仅分离到的植物PGIP蛋白质在体外表现出较高的抑制病原PGs的活性[17]，转PGIP基因的植物也表现出较强的抗真菌病害的能力。转猕猴桃PGIP基因的苹果树对病原真菌的抗性明显增强[18]。转梨PGIP基因的马铃薯（Solanum tuberosum）对灰霉菌（Botrytis cinerea）的感染力明显下降[19]。而多数拟南芥属植物导入了拟南芥（Arabidopsis thaliana）Atpgip1和Atpgip2基因以后，对灰霉菌的抗性明显增强[20]。这些研究都充分说明PGIP基因在植物抗病分子育种的应用前景非常广阔。

枯草芽孢杆菌在工业发酵和微生物分子遗传学领域具有重要研究价值[21]。由于其具有遗传背景清楚、不分泌内毒素、生物安全性高等优点，枯草芽孢杆菌表达系统也被用作外源基因表达的优良宿主[22]。在植物病害生物防治领域枯草芽孢杆菌菌株具有广泛的应用前景[23]。

该研究中，笔者根据林烟草（Nicotiana sylvestris）PGIP基因设计特异性引物从普通烟草小黄金中克隆得到了PGIP基因的序列，分析了其基因组DNA结构，预测了其信号肽序列并构建了枯草芽孢杆菌表达系统，实现了在WB600菌株中的表达，分析了表达蛋白质对来自于辣椒疫霉PGs的抑制作用。为进一步研究烟草PGIP基因的功能及开发具有广谱抗真菌的生防菌株奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料为普通烟草种植品种小黄金嫩叶，液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存。

大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、Trans-DNA marker 2 kb plus、T4 DNA连接酶、pEASY-T1克隆载体为北京全式金公司产品；pHT43枯草芽孢杆菌表达载体及枯草芽孢杆菌菌株WB600为杭州宝赛生物技术有限公司产品；限制性内切酶XbaⅠ和SmaⅠ为NEB公司产品；Trizol试剂为Invitrogen公司产品；反转录试剂盒采用Takara公司的PrimeScriptRT reagent kit with gDNA eraser；蛋白质Marker为北京博迈德生物技术有限公司产品；其他生化试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 基因组DNA、总RNA提取及DNA片段的扩增

基因组DNA提取采用CTAB法进行。总RNA的提取采用Trizol试剂盒说明书进行；cDNA第一条链的合成按照PrimeScriptRT reagent kit试剂盒说明书进行。根据林烟草的PGIP基因设计特异性引物用来扩增克隆至pEASY-T1克隆载体的基因片段。设计的上游引物Tpig17F序列为：5′-ATGCTTCATAAAATGAAAACCTC-3′和下游引物Tpig17R序列为：5′-TCACGATTTACAAGGTGGCAA-3′。分别以烟草gDNA和反转录合成的cDNA第一链为模板进行PCR，程序为：94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。

扩增后的DNA经过凝胶回收纯化后，连接至pEASY-T1载体，挑选3个阳性克隆送上海博尚生物科技有限公司进行序列测定。

1.3 烟草PGIP基因的序列分析及进化树构建

从GenBank下载不同物种的PGIP基因序列，采用DNAMAN软件进行多序列比对；用MEGA 5.0的最大似然法进行遗传进化树构建；用SignalP 4.1 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽序列预测；利用Predictprotein在线网站（https：//www.predictprotein.org/）对推断的氨基酸序列二级结构进行预测。

1.4 烟草PGIP基因成熟肽序列扩增及枯草芽孢杆菌重组表达载体的构建

根据上述“1.2”获得的烟草PGIP基因序列，设计1对用来扩增PGIP基因成熟肽片段的引物se17，其上游引物se17F序列为：5′-CGCTCTAGAGAAAGATGCAATCCAAATGA-3′，下游引物se17R引物序列为：5′-TACCCCGGGTCACGATTTACAAGGTGGCAG-3′。其中上游引物根据需要添加了Xba Ⅰ酶切位点，下游引物添加了Sma Ⅰ酶切位点（引物序列中下划线所示）。PCR扩增程序如下：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物经回收纯化后克隆至pEASY-T1，挑选3个阳性克隆送上海博尚生物科技有限公司进行序列测定，测序正确的质粒命名为p-TR1。

将该质粒大量制备后和pHT43质粒同时进行双酶切，回收目的基因小片段和质粒大片段。将目的片段进行T4连接酶连接后再转化DH5α，经过50 μg/mL氨苄培养基筛选和菌落PCR鉴定为阳性的菌株送公司测序，序列测定正确的质粒命名为pHT-TR1。

1.5 枯草芽孢杆菌感受态细胞制备及质粒转化

按照李瑞芳等[24]的方法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞及进行质粒的转化。挑取单一WB600单菌落接种于2.5 mL 培养基GM1中（1.00 mL 10 × Spizizen salts， 0.10 mL 10%酵母粉， 0.25 mL 20% 葡萄糖， 0.20 mL 1%水解酪蛋白质， 补充灭菌蒸馏水至总体积10 mL），30 ℃ 150 r/min振荡培养过夜后，按照10%的接菌量接种于新鲜配制的5 mL GM2（1.00 mL 10 × Spizizen salts， 0.05 mL 10%酵母粉， 0.25 mL 20%葡萄糖，0.04 mL 1%水解酪蛋白质， 0.05 mL 0.1 mol/L CaCl2， 1.00 mL 25 mmol/L MgCl2， 补充灭菌蒸馏水至总体积10 mL）中进行传代，30 ℃ 250 r/min振荡培养90 min后取1 mL培养液在5 000 r/min室温离心10 min，用200 μL新鲜的GM2溶液重选菌液，即为感受态细胞。取适量质粒加入新制备的感受态细胞中使终浓度为1 μg/mL，混匀后30 ℃水浴60 min后，30 ℃ 200 r/min振荡培养3 h，涂布在含有氯霉素（10 μg/mL）的LB固体平板上，30 ℃过夜培养至单克隆出现。

1.6 SDS-PAGE对重组蛋白质表达的检测

挑取上述单克隆在含有氯霉素（10 μg/mL）液体LB培养基中进行培养，培养至OD600为1.0时加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG进行诱导，诱导6 h后补加氯霉素使其终浓度为10 μg/mL，诱导至16 h后取1 mL菌液进行10 000 r/min离心收集，加入适量5×上样buffer后进行12%的SDS-PAGE电泳。以没有添加IPTG进行诱导的菌株作为对照。

1.7 PGIP粗蛋白质对辣椒疫霉PGs的抑制作用

辣椒疫霉菌PGs诱导方法参考Wang等[16]报道的方法进行。将辣椒疫霉菌接种于燕麦培养基上，28 ℃培养7 d。从菌落边缘打10 mm菌丝块，放入盛有100 mL Czapek培养基（0.2% NaNO3，0.1% K2HPO4， 0.05% MgSO4·7H2O，0.05% KCl，0.001% FeSO4）的250 mL三角瓶中（每个菌丝块10 mL培养基）。培养3～5 d，培养物在4 ℃下，以12 000 r/min离心30 min，然后用Whatman GF/A 过滤，用0.1 mol/L pH 5.0乙酸钠透析浓缩即为粗PGs。采用琼脂扩散法测定重组蛋白质对辣椒疫霉PGs的抑制活性。首先倒琼脂板，用0.05 mol/L pH 5.0醋酸缓冲液溶解0.5%多聚半乳糖醛酸和0.8%琼脂糖，每个板打6个0.4 cm圆孔，每孔加入20 μL辣椒疫霉菌PGs浓缩液后，分别加入10、20、30、40 μL粗蛋白质及适量体积的Tris-HCl（pH 8.0），使其最终体积为60 μL，阴性对照采用加入40 μL WB600菌株发酵液，阳性对照加入40 μL经100 ℃煮沸10 min灭活的粗蛋白质。30 ℃孵育12 h 后，用0.1%钌红溶液静置染色1 h左右，倒去表面残留的染色液，再用去离子水冲洗，观察透明圈的大小。根据透明圈的大小确定重组蛋白质对辣椒疫霉菌PGs的抑制程度。

2 结果与分析

2.1 烟草PGIP基因的获得及序列分析

利用基因特异性引物Tpig17F和Tpig17R分别从小黄金烟草叶片的cDNA和gDNA中各扩增得到了一条约1 000 bp的片段（图1），将扩增产物回收克隆、测序后得到了烟草PGIP基因的序列。序列比对发现从gDNA中得到的序列和cDNA得到的序列只有个别碱基的不同，从而可确认该PGIP基因不含有内含子序列。

由图2可知，该烟草PGIP基因全长1 017 bp，编码一个长338 个氨基酸的多肽。将获得的序列申请GenBank数据库注册序列号为KF500525。利用SignalP 4.2对推断的烟草PGIP基因进行了信号肽预测，烟草PGIP基因信号肽序列长28个氨基酸，信号肽切割位点位于S28和E29之间。利用Predictprotein在线网站对推断的氨基酸序列二级结构进行预测。结果表明，推断的烟草PGIP基因包含有4个N-糖基化位点和10个重复的LRR保守序列，其中之一为典型的24个氨基酸长的富含亮氨酸重复序列（LSQLSNLEFLGLDRNKLTGPIPES）。进一步分析发现烟草PGIP基因所编码氨基酸富含亮氨酸残基在开放阅读框里共编码49个亮氨酸，占所有编码氨基酸的14.5%。

2.2 序列比对及进化树构建

利用DNAMAN软件将烟草（Nicotiana tabacum，Nt）PGIP基因和来源于苹果（Malus domestica，Md）、樱桃（Prunus mahaleb，Pm）、马铃薯（Solanum tuberosum，St）、海岛棉（Gossypium barbadense，Gb）、辣椒（Capsicum annuum，Ca）和巨桉（Eucalyptus grandis，Eg）的PGIP基因进行多序列比对发现，烟草PGIP基因和其他物种报道的PGIP基因具有相似的保守序列和功能区域；同源性分析发现烟草PGIP基因和辣椒的PGIP基因同源相似性达到了79.9%（图3）。用MEGA 5.0软件最大似然法构建的遗传进化树表明，烟草PGIP基因和辣椒PGIP基因具有最近的亲缘关系，如图4所示。

2.3 SDS-PAGE对烟草PGIP在WB600中表达的分析

阳性克隆经过1 mmol/L IPTG小量诱导后取1 mL发酵液进行离心收集蛋白质和菌体，加入上样缓冲溶液后煮沸进行电泳，结果如图5所示。由图5可知，重组菌株经过诱导后在35 ku处出现一条蛋白质条带，而阴性对照没有出现该蛋白质条带。据此可知，重组菌株已成功表达目的基因。

2.4 PGIP粗蛋白质对辣椒疫霉PG的抑制作用

由图6可知，阴性对照（图6a）和阳性对照（图6b）可形成较大水解透明圈，加入PGIP粗蛋白质对来源于辣椒疫霉的PGs具有明显的抑制作用；当加入较少粗蛋白质时，水解透明圈明显变小（图6c、图6d）；随着粗蛋白质浓度的增加，抑制效果也增强，水解透明圈已经非常小（图6e、图6f）；充分说明烟草PGIP基因已经成功在枯草芽孢杆菌中获得了表达。

3 讨论

PGIP及其类似分子作用多样化，它们很可能参与了花器官发育[25]、花粉形成[26]和抗逆性[27]等过程。同样地，在植物防御反应中PGIP分子具有重要作用，也可作为抗病分子育种的重要候选基因。

有研究发现，植物抗性基因的表达产物一般都含有LRR保守区域[28]。LRR结构由β-折叠/β-转角/β-折叠/α-螺旋结构区域构成，被认为是参与蛋白质与蛋白质相互作用的关键区域[29]，而植物正是通过这些LRR区域识别外源病原分子，从而激活防卫反应[30]。现有的研究证实，高等植物PGIP超家族均具有典型的富含亮氨酸重复序列（LRR）[31]。典型的植物PGIP基因一般包括一个信号肽和几个潜在的糖基化位点，并含有10个重复的LRR保守序列，其共有氨基酸序列为LXXLXLXXNXLXGXIPXXLAXLXXLRR，长度一般为20～29个氨基酸，其中核心保守序列为LXXLXLXXNXL[32]。笔者的研究发现，普通烟草的PGIP基因同其他植物上报道的PGIP基因一样也具有10个LRR重复序列，其中一个是典型的LXXLXLXXNXLXGXIPXXLAXLXXLRR区域。这与在水茄[15]、棉花[9]和桃[10]等PGIP基因上的研究是一致的。另外，序列分析发现烟草PGIP基因富含亮氨酸残基，在开放阅读框里共编码49个亮氨酸，占所有编码氨基酸的14.5%。类似的结果也在其他物种的PGIP基因被发现，桃的PGIP基因亮氨酸比例高达16.06%（53/330），其中49个是植物中非常保守的[10]；而油菜中亮氨酸有50个，占氨基酸残基总数的14.88%[13]。序列分析发现，烟草PGIP基因只有4个N-糖基化位点，少于油菜的5个[13]，水茄的9个[15]，大白菜的6个[11]和桃的7个[10]。N-糖基化位点的数目对烟草PGIP活性的影响需要进一步去深入研究。

目前已有少量植物的PGIP基因已经实现了在大肠杆菌的高效表达。刘睿洋等[13]将湘油15的PGIP9基因亚克隆至pET32a表达系统，实现了在大肠杆菌的融合表达，但表达的融合蛋白质以包涵体形式存在。熊帅等[33]将富士苹果的PGIP基因亚克隆至pET32a表达系统，同样发现表达产物以包涵体的形式存在。这些报道发现采用pET32a表达系统表达的重组PGIP蛋白质均比预期蛋白质大的多，且均为不溶性的包涵体占多数，这在一定程度上影响了蛋白质功能的研究。王秀菊[34]的研究发现，将辣椒的3种PGIP基因重组至pET28a表达系统后，表达的重组蛋白质分子质量均与预期相符，可溶性蛋白质的比例较高，而且表达的重组蛋白质对辣椒疫霉等11种真菌或卵菌产生的PGs有较好的抑制作用。除了大肠杆菌表达系统以外，酵母表达系统也是一种有效的表达PGIP蛋白质的途径。燕孟郊[35]发现利用毕赤酵母表达系统表达的油菜PGIP基因具备一定的抑制黑胫病病原NM-1分泌的PGs的作用。目前，很少有关于PGIP基因在枯草芽孢杆菌中表达的相关报道。作者的研究证实，烟草的PGIP基因可以实现在枯草芽孢杆菌菌株WB600中分泌表达，表达的产物具有较好的抑制真菌PGs的活性。这为进一步实现PGIP基因在枯草芽孢杆菌生防菌株中的表达提供了参考资料，也为进一步研究PGIP基因的功能积累了实践经验。

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