多粘芽孢杆菌发酵放大工艺研究

周荣华++崔怡宁++饶犇++廖先清++杨自文

摘要：研究多粘芽孢杆菌的发酵放大工艺，探索在5t发酵罐中采用不同溶氧、不同碳源A浓度及不同种类的碳源对发酵的影响。结果表明，混用碳源B和碳源C可以较好的阻止多粘芽孢杆菌自溶，大部分菌体形成芽孢，发酵液中的芽孢数量为5亿/mL，这些研究为后面的工业化生产打下了良好的基础。

关键词：多粘芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）；放大；自溶

中图分类号：Q813.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2634-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.019

Scale-up Fermentation of Paenibacillus polymyxa

ZHOU Rong-hua1，CUI Yi-ning2，RAO Ben1，LIAO Xian-qing1，YANG Zi-wen1

（1.National Biopesticide Engineering Research Center， Hubei Academy of Agricultural， Wuhan 430064， China；

2.Wuhan High School， Wuhan 430061， China）

Abstract： We studied the scale-up fermentation of Paenibacillus polymyxa. Different dissolved oxygen， different concentration of carbon source A and different types of carbon sources on the impact of fermentation were studied at 5 tons fermenter. The results showed that the carbon B combined with carbon C can well prevent autolysis of Paenibacillus polymyxa and most bacteria can form spores. The number of spores in the fermentation broth was 500 million/mL. All these lay a good foundation for the industrialization.

Key words： Paenibacillus polymyxa； scale-up； autolysis

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢杆菌科（Bacillaceae）类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的革兰氏阳性细菌。多粘类芽孢杆菌细胞呈杆状，大小为（0.5～2.5） μm×（1.2～10.0） μm，G+C含量为40%～50%；利用周生鞭毛运动，在膨大孢子囊中产生椭圆型芽孢；最适生长pH为7，最适温度为28 ℃～30 ℃；兼性厌氧，能分解葡萄糖和其他糖类产酸，有时产气，在营养琼脂上无可溶性色素，应用前景广阔[1]。

多粘类芽孢杆菌能分泌大量的活性物质，对许多细菌和真菌有抑制活性，能提高植物的抗病能力，促进植物生长，提高产量，并能产生多肽类抗菌物质对植物病原真菌有较好的拮抗活性，是一种较好的生防细菌。另外，多粘芽孢杆菌还具有多种酶活、抗氧化及抗肿瘤等生物活性。随着多粘类芽孢杆菌研究的深入，它在工农业领域、医药领域、生物学理论研究方面将有更广阔的应用前景[2，3]。尽管多粘芽孢杆菌有着良好的应用前景，但是目前大部分研究主要停留在实验室阶段，市场上的产品并不多见，仅仅有的几个产品芽孢数量也不高，这主要是因为该菌的发酵放大至生产规模后过程较难控制，发酵水平不稳定，并且常常在发酵末期菌体大量自溶，而不是形成芽孢，这成为了阻碍多粘芽孢杆菌产业化的重要因素。

为了解决上述问题，本研究以分离得到的多粘芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa NR1为研究对象，研究不同的发酵放大策略，完成了多粘芽孢杆菌在5 t发酵罐中的发酵放大研究，发酵液芽孢数为5亿/mL，在国内市场中处于较为领先地位。

1 材料与方法

1.1 菌株

多粘芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa NR1为自行筛选得到。

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基 在1 000 mL去离子水中加入质量体积比为2.0%葡萄糖、2.0%蛋白胨、2.0%酵母浸粉，121 ℃灭菌15 min。

1.2.2 初始发酵培养基 在1 000 mL去离子水中加入质量体积比为2.5%碳源A、2.0%豆粕、1.0%蛋白胨、1.0%酵母粉、0.5%碳酸钙、pH 6.5～7.0，121 ℃灭菌15 min。

1.3 5t发酵罐发酵放大研究

从斜面上接种一环菌入摇瓶种子培养基中，28 ℃，200 rpm/min下培养至对数期后期，以5%接种量接入5t发酵罐，装料3t，罐压0.02 MPa，在发酵过程中通过调整空气流量对溶氧进行控制，因加入了碳酸钙，故pH不予控制。

1.4 发酵放大策略研究

1.4.1 不同溶氧下发酵放大 将流量分别设置在20、40、60、80、100 m3/h下进行多粘芽孢杆菌的发酵，发酵40 h，对发酵液进行镜检和芽孢计数。

1.4.2 不同浓度碳源A发酵放大 基础发酵液里面分别添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的碳源A，空气流量设置为80 m3/h，发酵40 h，对发酵液进行镜检和芽孢计数。endprint

1.4.3 不同碳源发酵放大 基础发酵液里的其他成分不变，分别使用2.0%的碳源A、碳源B、碳源C、1.0%碳源A+1.0%碳源C及1.0%碳源B+1.0%碳源C，空气流量设置为80 m3/h，发酵40 h，对发酵液进行镜检和芽孢计数。

1.5 分析方法

1.5.1 溶氧测定 梅特勒溶氧电极在线测定。

1.5.2 芽孢数测定 活菌数按常规平板计数法测定[4]，检测芽孢数前，将菌液在80 ℃预处理20 min，再按照常规平板计数法测定[5，6]。

2 结果与分析

2.1 不同溶氧下发酵放大结果

根据前期200 L发酵罐研究结果，当空气流量较大时，超过0.6 vvm的时候，多粘芽孢杆菌会过度生长，从而在发酵末期多粘芽孢杆菌的菌体会全部自溶，鉴于此，将空气流量设定为不超过100 m3/h。尝试5种不同的空气流量，即20、40、60、80、100 m3/h，发酵结束后涂片观察并对发酵液进行计数，结果见表1。由表1可知，尽管调低空气流量能在一定程度上降低多粘芽孢杆菌自溶频率和提高芽孢形成率，但是即使将流量设定在了20 m3/h，最终发酵液中的菌体大部分发生自溶，只形成了少量的芽孢，表明单纯的降低空气流量并不能提高芽孢形成率。

2.2 不同浓度碳源A下的发酵放大

低通气量并不能阻止多粘芽孢杆菌的过度生长和其在发酵后期的自溶，在此考虑调整碳源A的使用量，探索此方法能否降低多粘芽孢杆菌的比生长速率，促进芽孢的生成，分别尝试4种不同碳源A添加量，即1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，发酵结束后涂片观察并对发酵液进行计数，结果见表2。由表2可知，改变碳源A使用量无法提高芽孢形成率，反而绝大部分都自溶了，表明碳源A用量不是影响多粘芽孢杆菌形成的关键因素，无法通过该方法获得合格的多粘芽孢杆菌产品。

2.3 不同碳源的发酵放大

通过调整碳源A的使用量并不能提高多粘芽孢杆菌的芽孢形成率，可能因为碳源A作为一种发酵型碳源，极易被多粘芽孢杆菌利用，即使减少其添加量也无法降低多粘芽孢杆菌的比生长速率。考虑使用迟效碳源B和碳源C，部分或者全部代替碳源A，考察其使用对于多粘芽孢杆菌形成芽孢的影响。分别使用2.0%的碳源A、碳源B、碳源C、1.0%碳源A+1.0%碳源C和1.0%碳源B+1.0%碳源C，发酵结束后涂片观察并对发酵液进行计数。由表3可知，将碳源B和碳源C混用可以获得良好的效果，该培养条件下多粘芽孢杆菌能形成大部分的芽孢，数量为5亿/mL。

3 小结与讨论

多粘芽孢杆菌是一种良好的生防促生菌，具有较好的市场前景和极高的应用价值，但是市场上的产品并不多见，主要是其发酵放大较为困难。本研究探讨了多种发酵策略对于多粘芽孢杆菌发酵放大的影响，发现混用碳源B和碳源C可以较好地阻止多粘芽孢杆菌自溶，大部分菌体形成芽孢，发酵液中的芽孢数量为5亿/mL，这些研究为后面的工业化生产打下了良好的基础。

参考文献：

[1] 郭兴华.益生菌基础与应用[M].北京：科学技术出版社，2002.

[2] 赵德立，曾子林，李 晖，等.多粘芽孢杆菌JW-725抗菌活性物质及其发酵条件的初步研究[J].植物保护，2006，32（1）：47-50.

[3] 李福彬，陈宝江，于会民，等.多粘芽孢杆菌抗逆性与益生性的体外评价[J].河北农业大学学报，2010，33（3）：78-82.

[4] 周德庆.微生物学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社，1986.

[5] 杜连祥.工业微生物学实验技术[M].天津：天津科学技术出版社，1992.

[6] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，1999.endprint