基于FIASCO技术的芝麻SSR标记及其遗传多样性分析

陶菲+童益琴++赵杰+南皓+杨立春+李江浩+葛台明

摘要：采用FIASCO法构建了芝麻（Sesamum indicum L.）GATA＼AAAG＼AAAC微卫星富集文库，阳性克隆率62%，其中58%为完美型SSR。利用30个芝麻材料对其中10个扩增稳定、多态性好的SSR位点进行了多样性分析，等位基因数介于4～7之间，平均6.2个；有效等位基因数介于2.18～5.13之间，平均3.73。25个育成品种（系）遗传相似系数平均为0.740 7，遗传距离平均为0.258 9；5个地方品种间的遗传相似系数平均为0.659 3，遗传距离平均值为0.312 8，说明地方品种多样性比育成品种（系）丰富。AMOVA分析表明，品种（系）间变异大于品种（系）内变异，地方品种种内变异大于育成品种（系）。聚类分析表明，一把白与所有育成品种（系）聚为同一类。研究还鉴定出一些遗传差异较大的材料。

关键词：芝麻（Sesamum indicum L.）；SSR标记；FIASCO；遗传多样性

中图分类号：S565.3∶Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2586-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.008

Development of SSR Markers and Analysis on Genetic Diversity in

Sesamum indicum L. Based on FIASCO

TAO Feia，TONG Yi-qinga，ZHAO Jiea，NAN Haoa，YANG Li-chuna，LI Jiang-haoa，GE Tai-minga，b

（a.Hubei Key Laboratory of Wetland Evolution and Ecological Restoration；

b. School of Environmental Studies， China University of Geosciences（Wuhan）， Wuhan 430074， China）

Abstract： In this study， 100 clones were randomly selected from the library enriched for GATA＼AAAG＼AAAC motifs using a modified FIASCO （Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats） protocol and sequenced in sesame （Sesamum indicum L.）. Sixty-two microsatellite loci， of which 58% were pure repeats， were isolated. 10 highly polymorphic microsatellite markers were obtained， and their polymorphism were assessed among 30 cultivars with 30 individuals per cultivar. The average number of alleles for these loci was 6.2 （range 4-7）. The effective number of alleles ranged from 2.18 to 5.13 with an average of 3.73. The expected heterozygosity was higher than the observed heterozygosity indicating the inbreeding effect due to breeding. These markers were also used to assess the genetic variation of 30 sesame cultivars. The results showed that the average genetic similarity coefficient and the average genetic distance of 25 breeding varieties were 0.7407 and 0.2589 respectively， and the average genetic similarity coefficient and the average genetic distance of 5 landraces were 0.6593 and 0.3128 respectively demonstrating that the genetic diversity of landraces was higher than that of breeding varieties. AMOVA analysis indicated that most genetic variation existed among varieties （strains） （P<0.001）. The results also implied that the genetic base of breeding varieties was narrower that that of landraces. Clustering analysis indicated that all 30 sesame varieties （strains） were classified into 2 groups. What's more， landrace Yibabai and all breeding varieties （strains） were clustered into 1 group showing that all the tested breeding varieties （strains） had very close genetic relationship. Some varieties with wide genetic variation were identified.endprint

Key words： sesame （Sesamum indicum L.）； SSR marker； FIASCO； genetic diversity

芝麻（Sesamum indicum L.）为胡麻科（Pedaliaceae）胡麻属（Sesamum）一年生草本植物，是世界上最古老的油料作物之一。芝麻种植区主要分布在温带和热带，其中印度、缅甸、苏丹和中国是较大的生产国。芝麻营养价值很高，富含蛋白质、氨基酸及丰富的矿物质、粗纤维及多种维生素[1]。早期芝麻遗传学研究多注重在形态学[2-4]及细胞学[5-8]特征上，这些标记因重复性差、标记数量少而未被广泛应用。DNA分子标记因不受环境影响，稳定性好及多态性高而在众多作物中有着广泛的应用。在芝麻分子水平研究中，采用了RAPD[9-11]、ISSR[12，13]、SRAP[14-16]、AFLP[17-19]、EST[20-22]等众多分子标记。

SSR（Simple sequence repeat）标记又称微卫星（Microsatellite）标记，具有丰富的多态性，符合孟德尔式共显性遗传的特性，且操作简便，已被成功应用于芝麻SSR遗传分析[23-25]。Laurentin等[26]通过分子方差分析发现供试种种间仅存在5%的变异。但总体来说，芝麻SSR标记仍然偏少，且多为重复单元较短的2碱基重复的SSR标记。这类短重复单元SSR标记在分析过程中极易产生严重的影子带，从而影响结果的准确性。因而，芝麻遗传多样性研究还需要开发更多的优质SSR标记，例如高多态性、扩增稳定、且具较长重复单元的优质SSR标记。

另外，由前人研究结果可知，芝麻育成品种的遗传基础较为狭窄[27]。为了指导遗传改良中的亲本选配，以及种质资源的研究，有必要了解地方品种和育成品种的遗传多样性及其差异。本研究应用FIASCO法[28]构建芝麻微卫星文库，通过所开发的微卫星标记研究了芝麻供试材料中育成品种（系）与地方品种的遗传相似系数和遗传距离，比较分析了育成品种（系）与地方品种种间及品种内的遗传差异，为今后芝麻育种亲本合理组配及杂种优势利用等提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试芝麻30个品种（系）的种子由中国农业科学院油料作物研究所（中油所）提供。供试材料包含育成品种（系）和地方品种两大类型，来源地分别为河南、山东、湖北、中油所及前苏联。其中25个供试材料为中油所保存、培育的芝麻育成品种（系）。地方品种中除塔世干122由前苏联引进，其余均源自中国。具体见表1。

1.2 方法

1.2.1 FIASCO法构建芝麻微卫星文库

1）芝麻基因组提取及纯化。将供试材料22M3724芝麻种子在25 ℃培养箱中发芽，取幼芽组织0.5 g，用常规CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取出丝状DNA沉淀后，转入纯化步骤。纯化方法如下：用1 mL含终浓度20 μg/ml RNase A的TE缓冲液（pH8.0）重新溶解沉淀，37 ℃保温30 min消化RNA，常规酚抽提后，异丙醇重新沉淀DNA，脱盐处理后重新溶解于TE（1 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH=8.0）。提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop2000检测其质量，计算浓度配成250 ng/μL DNA备用。

2）SSR标记的分离及引物设计。基因组DNA经内切酶CviQI（Biolabs）酶切3 h。酶切体系（50 μL）包括：4 U CviQI内切酶，250 ng DNA，1×NE Buffer 3 μL，100 μg/mL BSA。将酶切产物与双链接头[接头A序列为：5′-gATgAgTCCTgACTAC（N）-3′， 接头B序列为：5′-gACgATgAgTCCTgAg-3′] （N代表碱基A， G， C， T）于16 ℃连接过夜，10 μL连接反应体系如下：1 μmol/L接头，25 ng DNA，5 μL Sollution I，2.5 μL Sollution Ⅱ。

连接产物用TE缓冲液按1∶9稀释后，以G+CviQI引物（5′-gATgAgTCCTgACTAC-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系（10 μL）包括：1×PCR 反应缓冲液，2.5 μmol/L G+CviQI引物，200 μmol/L dNTPs， 1∶9稀释的连接产物 2.5 μL，0.25 U Taq DNA聚合酶，2 mmol/L MgCl2。反应程序如下：94 ℃预变性5 min，循环（94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s） x次，72 ℃延伸10 min，x为22，24及26，以PCR产物在250～750 bp之间且形成明显的smear为最佳循环次数。

将40 μL PCR产物与3′带生物素标记的寡核苷酸探针（GATA）6、（AAAC）6和（AAAG）6（分别1 μmol/L）进行杂交，杂交条件如下：95 ℃变性2 min，在各探针退火温度（Ta=Tm-2，各探针Tm值由NEB公司网站计算得出）下杂交30 min，缓慢冷却至室温。再加入12.5 μL 的5 mol/L NaCl使得Na+终浓度为1 mol/L。M280链酶亲和素磁珠（Promega）用TEN1000洗涤3次后用49 μL TEN100平衡，之后加入1 μg经超声波打碎的E. coli DNA封闭磁珠表面非特异结合位点。将杂交产物与处理的磁珠混匀，按照Zane等[28]描述的方法，进行非严谨洗脱和严谨洗脱，最后95 ℃水浴10 min，水浴后将离心管置于磁力架上，吸出富含目标SSR单链DNA的片段。

以上述洗脱液为模板，用引物G+CviQI进行第二次PCR扩增，检测富集效果。PCR反应体系及程序如上。PCR扩增后效果好的样品经BioTeke PCR产物纯化试剂盒纯化，纯化产物按说明书与PMD18-T载体（Takara公司）连接，转化到本实验室自制的Top10感受态细胞中。挑取阳性单菌落送往武汉擎科生物技术有限公司测序。将反馈回来的测序结果用SSRHunter 1.3软件挑选出含有SSR标记的DNA片段。endprint

选取合适的SSR重复序列作为引物设计的原始序列。应用Primer Premier5.0软件（http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign/）初步设计引物，通过Oligo6.0软件完成引物评价。选取得分较高的引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 芝麻SSR分型 在进行PCR扩增之前，对每对引物设计一个温度梯度试验。该温度梯度包含Primer Premier5.0、Oligo6.0软件及上海生工生物工程有限公司提供的最佳退火温度，以找出最佳PCR扩增条件。

将供试芝麻品种的每个品种随机播种30个个体，每个个体单独用Chelex-100法[29]快速提取出DNA，用作引物扩增的模板DNA。

在各引物优化最佳退火温度（Ta）下进行PCR（10 μL）：1×Taq 反应缓冲液（含Mg2+），0.2 μmol/L 正向引物，0.2 μmol/L反向引物，200 μmol/L dNTP，10 ng 个体DNA，0.25 U Taq DNA聚合酶。反应条件如下：94 ℃预变性5 min，循环（94 ℃ 、30 s，Ta、30 s，72 ℃、30 s）30次，72 ℃延伸10 min。扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染。

1.2.3 数据分析 将银染分型的基因型数据，使用POPGENE Version 1.31计算各基因座在群体中的等位基因数（Na），有效等位基因数（Ne），杂合度（Ho），期望杂合度（He）等参数。通过PIC_CAL软件计算出每个SSR位点的PIC值（polymorphic information content）。按照带型和样本数及名称建立一个“0，1”矩阵的Excel文档，转入到NTSYSpc Version 2.10e软件中进行UPGMA聚类分析和计算遗传距离及遗传相似系数。基于每一位点等位基因的差异，采用ARLEQUIN Ver 3.0软件中的AMOVA （Analysis of Molecular Variance）程序计算品种（系）间及品种（系）内的遗传变异。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取

供试芝麻品种22M3724的OD260 nm /OD280 nm为1.97，从图1A可以看出，芝麻基因组DNA大小在5 kbp以上，点样孔干净，无拖尾、杂带，主带清晰，点样孔内无残留。表明提取的芝麻基因组DNA纯度高，质量好，能满足后续试验要求。

2.2 微卫星文库的构建

酶切产物经PCR扩增后，主要片段集中在250～750 bp之间（图1B），Smear条带明显，符合构建微卫星文库的要求。第二次PCR的扩增结果见图1C，其中22个循环次数下富集到的DNA片段偏大，且Smear亮度不及24和26个循环次数，在后续的测序中有可能超出测序图谱的置信区间。24和26循环次数下的富集片段大小合适（250～750 bp），Smear条带明显。因此用24和26循环次数的PCR富集产物构建文库，共获得约300个克隆，随机挑选100个克隆进行测序，其中62个含有微卫星序列（62%）。

依据Weber[30]提出的微卫星序列分类标准，62个微卫星位点中，完全型微卫星36个，占58%；非完全型和复合型各13个，均占21%。另根据重复单元进行分类，重复次数大于或等于10的二碱基微卫星28个，占45.2%；重复次数大于或等于8的三碱基微卫星8个，占12.9%；重复次数大于或等于5的四碱基微卫星24个，占38.7%；重复次数大于或等于3的六碱基微卫星仅2个，占12.9%（表2）。三碱基及以上重复单元的SSR序列占到了全部SSR序列的大约55%，表明所建立的SSR富集文库质量优良。这些序列为后续多样性分析提供了方便。

2.3 引物设计结果与优化

用引物设计软件Primer Premier5.0共设计引物50对，转入Oligo6.0软件评价得出得分最高的22对引物（GB Acc. No. KM521246-KM521267），引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。优化PCR反应条件，以引物SIL-4为例（图1D），期望产物片段大小157 bp，复性温度43～45 ℃下扩增条带均位于250 bp以上，46 ℃下开始出现目标片段但杂带较多，48 ℃复性温度下无杂带，目标片段明显，则最佳复性温度为48 ℃。筛选出10对能够稳定且特异性扩增的引物，引物序列见表3。图1E为引物SIL-6的扩增结果。

2.4 多态标记筛选

10对微卫星引物在所有芝麻品种中均得到了较好的扩增，图2为SIL-3引物在16个芝麻品种（系）间及D015品种内的扩增结果。

10个多态位点的等位基因数介于4～7之间，平均为6.2个，有效等位基因数为2.183 5-5.125 2，平均为3.725 6；观测杂合度的变化范围为0.002 2-0.660 0，平均为0.227 5；期望杂合度为0.610 0-0.805 3，平均为0.714 7；多态性信息含量PIC为0.488～0.776，平均为0.675（表4）。

2.5 不同品种（系）间的遗传多样性及遗传分化

供试材料中25个为育成品种（系），5个为地方品种。分别对育成品种（系）和地方品种进行分析。表5显示，25个育成品种（系）的SSR标记的遗传相似系数平均为0.740 7，遗传距离平均为0.258 9，亲缘关系最近的是中油所的22M2202和22M2511，遗传相似系数达到0.925 9，最远的是22M2165和22M0968及22M2165和22M3375，相似系数均只有0.481 5；5个地方品种间的遗传相似系数平均为0.659 3，遗传距离平均值为0.312 8，亲缘关系最近的是湖北的一把白与河南的二郎花芝麻，亲缘关系最远的是山东的大青秸和襄阳的鄂芝2号及苏联的塔世干122和湖北的一把白。地方品种间的平均遗传相似系数小于育成品种（系），而平均遗传距离大于育成品种（系），说明地方品种的遗传多样性比育成品种（系）的遗传多样性丰富，遗传基础较育成品种（系）宽。endprint

AMOVA分析表明，SSR遗传变异绝大部分存在于种群间，贡献的遗传变异为73.11%（表6）。无论从总体看，还是以育成品种（系）与地方品种分别考察，品种（系）间的遗传分化均极显著高于品种（系）内的遗传分化水平，P<0.01，表明芝麻SSR标记的遗传多样性主要存在于品种（系）间。

2.6 聚类分析

在相似系数0.61处30份材料被聚为两类（图3）：25份育成品种（系）和地方品种一把白为一类（A），表明所有25个育成品种（系）与一把白具有相近的亲缘关系。4份地方品种为另一类（B）。

A类在相似系数0.722处被分成4个亚类：A1、A2，A3，A4。相似系数0.79处A1进一步被分为3个亚亚类：6份材料（22M0624、22M0625、22M0773、22M0663、22M0785、22M0801）、中芝13和3份材料（22M2118、22M2147、22M2149）；地方品种一把白位于A2亚类中；A3亚类存在亲缘关系最近的两份材料（22M2202和22M2511）；A4亚类中仅含22M3375和22M3395品种。

B类在相似系数0.65处可被分为2个亚类：河南的二郎花芝麻和山东的大青秸为一个亚类（B1），湖北的鄂芝2号和苏联的塔世干122为另一亚类（B2）。

3 讨论

本研究随机测序了100个克隆子，其中62个含有SSR序列，总阳性克隆率为62%。可见，FIASCO富集文库法是一种高效的SSR分离方法。不同研究者[31，32]建立的FIASCO富集文库的阳性克隆率有一定的差别，其主要原因可能是建库过程中使用的条件不同，尤其是杂交温度、洗脱严谨度（洗脱温度和次数）等的差异。因此，探针杂交和富集是构建FIASCO富集文库是否成功的两个关键步骤。首先，能否选择合适的杂交温度很重要。与目的SSR序列杂交的每个探针的杂交条件都不同，而且同一探针的不同公式计算的Tm值都有差异。所以，必须正确选择合适的杂交温度。其次，能否选择合适的洗脱强度是很重要。如果洗脱严谨度过高，则可能特异结合的DNA片段被洗掉而降低富集率。如果洗脱严谨度过低，则不能充分洗掉具有部分同源性的非特异DNA片段而降低富集率。Zane等[28]采用3次严谨的洗脱和3次非严谨的洗脱保证目标片段的有效性。Nunome等[33]提出富集效率主要取决于杂交温度与洗脱次数。其中探针同预扩增产物杂交的温度对富集率影响不大，而富集过程中洗脱的次数对富集率影响较大。作者认为富集率的高低会受多方面的因素，而不是仅仅一个富集次数或温度等单方面的因素的限制。杂交富集过程中的杂交温度、洗脱温度、洗脱次数以及洗脱液的盐浓度等多因素都会影响富集效率。从测序结果看，我们富集到了较多的4碱基重复的SSR，而4碱基重复SSR具有多态性好、扩增带纹清晰、影子带干扰小等一系列优点。说明富集工作比较成功。

经由FIASCO法构建的微卫星文库所得到的10个微卫星位点等位基因数平均为6.2个，有效等位基因数平均为3.7个，与Nweke等[25]得到的结果相似。观测杂合度的变化范围为0.002 2-0.660 0，平均为0.227 5；期望杂合度为0.610 0～0.805 3，平均为0.714 7。若期望杂合度与观测杂合度数值接近则说明该物种受种内近交及外来选择等因素的影响较小，可认为群体整体处于遗传平衡状态。对比可知期望杂合度数值均高于观测杂合度数值，说明芝麻群体内因育成品种（系）比例大而受种内近交及外来选择因素影响。多态性信息含量PIC代表一个标记依靠其可检测的等位基因数和分布频率，得出该标记在一个群体中的多态性数值。Spandana等[34]以60份芝麻种质资源为试验材料，PIC均值高达0.77。本研究多态信息含量PIC为0.488～0.776，根据Botstein等[35]提出的标准，除SIL-8之外其余位点均属于高度多态性（PIC>0.5），因此这些标记用于遗传多样性分析效果较好。

应用SSR标记进行作物品种间的遗传相似性系数和遗传距离的报道较多，张涛等[36]利用微卫星标记分析得出32个香稻品种的遗传相似系数变化范围为0.51～0.96。孙友位等[37]用SSR分析了85个玉米自交系，遗传相似系数平均为0.66。杨先泉等[38]对四川马铃薯21份地方品种和10个育成品种进行了RAPD分析，得到地方品种间平均遗传距离和变幅高于育成品种。本研究25个育成品种（系）的SSR标记的遗传相似系数平均为0.740 7，遗传距离平均为0.258 9；5个地方品种间的遗传相似系数平均为0.659 3，遗传距离平均值为0.312 8。结果表明地方品种的遗传多样性较育成品种（系）丰富。孙建等[39]用SRAP标记对67个中国芝麻主要品种的分析得出杂交选育品种间的遗传相似系数和遗传距离平均分别为0.910 7和0.067 2，地方品种的遗传相似系数和遗传距离平均分别为0.895 0和0.071 4，与上述结果有着明显差异。这可能与实验材料不同、选用的分子标记和选用的各类型品种个体数量偏少有关。

遗传变异是反映遗传分化的重要指标。如前所述，本研究AMOVA分析结果表明，SSR遗传变异绝大部分存在于品种（系）间。无论育成品种（系）还是地方品种，相比品种（系）内变异，品种（系）间的遗传变异均达到极显著水平（P<0.01），说明供试材料间遗传分化明显，不同类型品种间遗传多样性较丰富。但育成品种（系）内变异百分比少于地方品种内变异百分比的1/2，这在分子水平上说明育成品种（系）遗传基础较地方品种窄。

聚类分析将大多数地方品种与育成品种（系）聚在2个不同的类中，地方品种一把白与所有育成品种（系）聚为同一类，表明供试育成品种（系）具有较近的亲缘关系，结果与AMOVA分析得出的“育成品种（系）遗传基础较地方品种窄”结论一致。育成品种（系）间除亲缘关系最近的22M2202和22M2511之外，大多材料相似度不尽相同；另4个地方品种来自不同地区，品种间遗传相似系数较低。分析认为，地方品种与育成品种（系）间亲缘关系较远，可能具有较高的杂交组配潜力。endprint

本研究成功地采用FIASCO法构建了芝麻微卫星文库，并成功得到10个扩增稳定、多态性好的微卫星位点。应用这10个微卫星标记对供试材料分析结果显示，地方品种比育成品种（系）的遗传多样性丰富。这些结果为芝麻品种的遗传改良和种质资源研究等奠定了基础。

致谢：感谢中国农业科学院油料作物研究所张秀荣和赵应忠研究员提供本研究所需芝麻品种（系）种子。

参考文献：

[1] 王 瑾，徐桂真，李玉荣，等.DNA分子标记技术在芝麻中的应用[J].中国农学通报，2009，25（14）：55-58.

[2] 张秀荣，冯祥运，肖唐华. 鄂豫皖芝麻种质资源品质状况分析[J]. 作物品种资源，1993（1）：26-27.

[3] BISHT I S，MAHAJAN R K， LOKNATHAN T R， et al. Diversity in Indian sesame collection and stratification of germplasm accessions in different diversity groups[J]. Genet Resour Crop Evol，1998，45（4）：325-335.

[4] QUENUM F J B.芝麻种质资源种子特征、生化和分子标记的分析研究[D].杭州：浙江大学， 2002.

[5] 柳家荣，丁法元，屠礼传.芝麻体细胞染色体的初步观察[J].河南农业科技，1980（1）：14-15.

[6] NAVA F A，GERDER M. Detection of enzymatic polymorphism in five sesame varieties（Sesamum indicum L.） using isoelectric focusing and disc gel electrophoresis[J]. Oleagineux， 1993（8-9）：365-372.

[7] SHIRO I，TERUHISA U. Genetic variations of isozymes in cultivated sesame（Sesamum indicum L.）[J]. Euphytica，1997，93（3）：375-377.

[8] 赵应忠， 程 勇，张秀荣，等.芝麻核心种质与非核心种质的同工酶研究[J].中国油料作物学报，1998，20（4）：29-34.

[9] BHAT K V， BABREKAR P P，LAKHANPAUL S. Study of genetic diversity in Indian and exotic sesame （Sesamum indicum L.） germplasm using random amplified polymorphic DNA（RAPD） markers[J]. Euphytica， 1999， 110（1）： 21-34.

[10] NANTHAKUMAR G，SINGH K N，VAIDYANATHAN P.Relationships between cultivated sesame （Sesamum sp.） and the wild relatives based on morphological characters， isozymes and RAPD markers[J].Genet Breed，2000，54：5-12.

[11] PHAM T D，BUI T M，WERLEMARK G，et al.A study of genetic diversity of sesame （Sesamum indicum L.） in Vietnam and Cambodia estimated by RAPD markers[J]. Genet Resour Crop Evol，2009，56（5）：679-690.

[12] KIM D H，ZUR G，DANIN-POLEG Y，et al.Genetic relationships of sesame germplasm collection as revealed by inter-simple sequence repeats[J]. Plant Breeding，2002，121（3）：259-262.

[13] 祁彩虹，金则新，李钧敏，等.野生芝麻ISSR-PCR扩增条件优化[J].江苏农业科学，2011，39（2）：80-83.

[14] 车 卓，张艳欣，孙 建，等.应用SRAP标记分析黑芝麻核心种质遗传多样性[J].作物学报，2009，35（10）：1936-1941.

[15] 孙 建，张艳欣，车 卓，等.我国江淮产区主要芝麻品种的SPAP指纹图谱分析[J].中国油料作物学报，2009，31（1）：9-13.

[16] 张艳欣，张秀荣，车 卓，等.应用SRAP标记分析白芝麻核心种质遗传多样性[J].中国油料作物学报，2010，32（1）：46-52.

[17] LAURENTIN H，RATZINGER A，KARLOVSKY P. Relationship between metabolic and genomic diversity in sesame （Sesamum indicum L.）[J]. BMC Genomics， 2008， 9： 250-260.

[18] 孙 建，涂玉琴，张秀荣.芝麻空间诱变品系（种）的DNA指纹分析[J].中国农业科学，2007，40（12）：2696-2701.

[19] 高桐梅，卫双玲，李春明，等.芝麻太空诱变效应及AFLP标记检测[J].华北农学报，2013，28（1）：227-233.endprint

[20] 魏利斌，张海洋，郑永战，等.芝麻EST-SSR标记的开发和初步研究[J].作物学报，2008，34（12）：2077-2084.

[21] 张艳欣，王林海，吕海霞，等.基于EST-SSR研究芝麻地方种质不同大小繁殖群体间多态性[J].中国农学通报，2011，27（18）： 90-93.

[22] 柯 涛，毛 晗，董彩华，等.芝麻EST-SSR引物的开发与应用[J]. 中国油料作物学报，2013，35（1）：43-47.

[23] SHARMA S N.， VINOD K， SHIVANGI M.Comparative analysis of RAPD and ISSR markers for characterization of sesame （Sesamum indicum L.） genotype[J]. J Plant Biochemistry & Biotechnology， 2009， 18（1）： 37-43.

[24] DIXIT A，JIN M H， CHUNG J W，et al.Development of polymorphic microsatellite markers in sesame （Sesamum indicum L.）[J]. Molecular Ecology Notes，2005，5（4）：736-738.

[25] NWEKE F N， UBI B E， KUNERT K. Simple sequence repeat polymorphisms in nigerian sesame cultivars and its relationship with morpho-agronomic traits[J]. Journal of Crop Improvement， 2011， 25（5）： 572-596.

[26] LAURENTIN H E， KARLOVSKY P. Genetic relationship and diversity in a sesame（Sesamum indicum L.） germplasm colletion using amplified fragment length polymorphism（AFLP）[J]. BMC Genetics， 2006， 7： 1-10.

[27] 裴新涌，李春明，秦灵灵.基于国外期刊英文文献浅析芝麻研究现状与发展趋势[J].河南农业科学，2014，43（5）：13-19.

[28] ZANE L，BARGELLONI L，PATARNELLO T.Strategies for microsatellite isolation： review[J]. Molecular Ecology，2002， 11（1）：1-16.

[29] 蔡翠霞，肖维威，康文杰，等.改良Chelex-100法快速提取转基因农产品DNA[J]. 生物技术通报，2011（10）：210-214.

[30] WEBER J L. Informativeness of human （dC-dA）n（dC-dT）n polymorphism[J]. Genomics，1990，7（3）：524-530.

[31] LIAO X L， ZHU B， YU X M， et al. Isolation and characterization of polymorphic microsatellites in a Yangtze River fish， brass gudgeon （Coreius heterodon Bleeker）[J]. Molecular Ecology Notes， 2006， 6（2）： 393-395.

[32] 匡刚桥，刘 臻，鲁双庆，等. FIASCO法筛选鳜鱼微卫星标记[J].中国水产科学，2007，14（4）：608-614.

[33] NUNOME T， NEGORO S，MIYATAKE K， et al. A protocol for the construction of microsatellite enriched genomic library[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2006，24（3-4）：305-312.

[34] SPANDANA B， REDDY V P， PRASANNA G J， et al. Development and Characterization of Microsatellite Markers（SSR） in Sesamum（Sesamum indicum L.） Species. Appl Biochem Biotechnol， 2012， 168（6）： 1594-1607.

[35] BOTSTEIN D， WHITE R L， SKOLNICK M， et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics， 1980， 32（3）： 314-331.

[36] 张 涛，郑家奎，徐建第，等.香稻品种的遗传多样性研究[J].中国农业科学，2008，41（3）：625-635.

[37] 孙友位，李明顺，张德贵，等.利用SSR标记研究85个玉米自交系的遗传多样性[J]. 玉米科学，2007，15（6）：19-26.

[38] 杨先泉，张 佳，刘 坚，等.应用RAPD分析四川马铃薯地方品种与部分栽培品种间遗传关系[J].中国农学通报，2010， 26（22）：40-44.

[39] 孙 建，张秀荣，张艳欣，等.中国芝麻主要品种遗传多样性特点及遗传基础演变[J].中国农业科学，2009，42（10）：3421-3431.endprint