SIRT1激活ERK1/2通路抑制大鼠心肌缺血再灌注时内质网应激相关蛋白的表达

吴 倩，刘新伟

(重庆医科大学附属第一医院 麻醉科， 重庆 400016)



研究论文

SIRT1激活ERK1/2通路抑制大鼠心肌缺血再灌注时内质网应激相关蛋白的表达

吴 倩，刘新伟*

(重庆医科大学附属第一医院 麻醉科， 重庆 400016)

目的研究大鼠心肌缺血再灌注时沉默信息调节因子1(SIRT1)对心肌内质网应激相关凋亡的影响及其与ERK1/2信号通路的关系。方法将大鼠随机分为6组：假手术组、缺血再灌注组、白藜芦醇+缺血再灌注组、白藜芦醇+EX527+缺血再灌注组、白藜芦醇+PD98059+缺血再灌注组、PD98059+缺血再灌注组，每组12只。结扎大鼠冠状动脉左前降支建立大鼠心肌I/R损伤模型。 TUNEL法检测心肌细胞凋亡；比色法检测LDH、CK-MB活性。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测心肌GRP78、caspase-12和CHOP mRNA的表达; Western印迹检测SIRTl、caspase-12、CHOP、磷酸化ERK1/2和总ERK1/2蛋白的表达。结果Res+I/R组与I/R组相比，心肌凋亡指数降低(P<0.05)，血清LDH及CK-MB活性降低，内质网应激相关凋亡的指标GRP78、caspase-12及CHOP的蛋白表达量和mRNA均降低(P<0.05);给予SIRT1抑制剂后与Res+I/R组相比，以上指标升高；Res+I/R组与I/R组相比，SIRT1及磷酸化ERK1/2蛋白的表达量均增加(P<0.05);而Res+EX+I/R组与Res+I/R组相比，SIRT1、磷酸化ERK1/2蛋白的表达量又降低(P<0.05)。结论SIRT1能够抑制大鼠在体缺血再灌注心肌的内质网应激凋亡相关蛋白表达，发挥保护心肌的作用，其机制可能与ERK1/2通路激活有关。

沉默信息调节；心肌缺血再灌注损伤；内质网应激；凋亡；ERK1/2通路

心肌缺血再灌注损伤是急性心肌梗死后溶栓疗法、经皮冠状动脉介入治疗、体外循环术后心肌损伤的重要机制之一。内质网应激相关凋亡已被证实参与了心肌缺血再灌注损伤[1]，并且其途径不同于经典的线粒体凋亡途径和死亡受体途径，所以抑制内质网应激相关凋亡无疑是减轻心肌缺血再灌注损伤的有效方法。目前研究发现心肌缺血预处理[2]与后处理[3]都能减轻内质网应激相关凋亡，但鉴于这些方法在临床运用中的局限性，提示需要找到新的靶点抑制内质网应激相关凋亡。

研究证实沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)能够有效减轻缺血再灌注损伤，但在心肌缺血再灌时，SIRT1对内质网应激相关凋亡途径的影响还未见报道，本研究观察大鼠心肌缺血再灌注时，SIRT1对内质网应激相关凋亡蛋白的影响及其对ERK信号通路的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组及模型建立:雄性SPF级SD大鼠72只，体质量200～250 g[重庆医科大学实验动物中心，质量合格证编号：NO.0002699，生产许可证编号：SCXK(渝)2012- 0001]。随机分为6组：假手术组(control)、缺血再灌注组(I/R)、白藜芦醇+缺血再灌注组(Res+I/R)、白藜芦醇+EX527+缺血再灌注组(Res+EX+I/R)、白藜芦醇+PD98059+缺血再灌注组(Res+PD+I/R)、PD98059+缺血再灌注组(PD+I/R)，每组12只。Control组：仅开胸，于大鼠左冠状动脉前降支根部穿线但不结扎；I/R组：结扎大鼠左冠状动脉前降支，结扎30 min后再灌注120 min；Res+I/R组：白藜芦醇溶于10 mg/kg分别于缺血前15 min及再灌注前1 min尾静脉给药；Res+EX527+I/R组：白藜芦醇加药情况同前，分别于缺血前15 min及再灌注前1 min尾静脉给药EX527 1 μg/kg；Res+PD98059+I/R组：Res加药情况同前，PD98059 0.3 mg/kg于缺血前10 min尾静脉注射；PD98059+I/R：PD98059加药情况同前。

1.1.2 主要试剂:白藜芦醇、PD98059和EX527(Sigma公司)；TUNEL试剂盒(Roche公司)；兔抗大鼠caspase-12抗体(Millipore公司)；兔抗大鼠CHOP(GADD153)抗体(Santa Cruz公司)；兔抗鼠SIRT1抗体、ERK1/2抗体、磷酸化ERK1/2(T202/Y204)抗体，β-actin和二抗(Immunoway公司)；实时荧光定量PCR的Trizol试剂盒、RNA反转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 TUNEL法检测心肌细胞凋亡:实验结束后，立即取各组大鼠心尖部位心肌常规固定、脱水、石蜡包埋、切片。按TUNEL检测试剂盒操作。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行凋亡细胞计数。心肌细胞凋亡率即凋亡指数(AI)=凋亡心肌细胞核数/心肌细胞核总数×100%。

1.2.2 心肌酶测定:大鼠再灌注120 min后，经左颈动脉取血样2 mL，3 500 r/min离心10 min，取上清液，采用比色法检测清乳酸脱氢酶(LDH)和MB型肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测GRP78、caspase-12及CHOP mRNA的表达:利用Trizol法按说明书提取目的细胞总RNA，Thermo浓度测定仪测RNA浓度后-80 ℃保存。按照反转录试剂盒说明书进行反转录得到cDNA，测浓度后-20 ℃保存。各组cDNA利用CFX96扩增仪分别扩增各目的基因。扩增条件为95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s，56～60 ℃不等退火30 s,72 ℃延伸10 min,共35个循环。以2-ΔΔCT计算所得结果。各目的基因引物列如下：GRP78正义链：5′-AACCCAGATGAGG CTGTAGCA-3′,反义链：5′-ACATCAAGCAGAACCAG GTCAC-3′。β-actin正义链：5′-ACGGTCAGGTCACT ATCG-3′,反义链：5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGA TG-3′。Caspase-12正义链：5′-TTGGAAGGTAGGCA AGAGTGG-3′，反义链：5′-TCAATGGTGGGCATCTGG GTC-3′。CHOP正义链：5′-AGCTGAGTCTCTGCCTT TCG-3′, 反义链：5′-TGTGGTCTCTACCTCCCTGG-3′。

1.2.4 Western blot法检测SIRT1、CHOP、caspase-12、磷酸化-ERK1/2、总-ERK1/2的蛋白表达：取各组大鼠心尖部位心肌，经匀浆器研碎。加裂解液，离心后吸取上清液，Bradford法测定蛋白质浓度。各标本取50 μg行SDS-PAGE电泳，蛋白转至PVDF膜，封闭液室温封闭后分别加入一抗和二抗。加人ECL试剂，暗室曝光，显影、定影。电泳成像系统定量扫描分析,结果以目的基因/内参吸光度比值表示。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 心肌组织TUNEL染色结果

与假手术组比较，其余各组心肌凋亡指数均增加(P<0.05)。与I/R组相比，Res+I/R组显著降低，PD98059+I/R组显著升高(P<0.05)；加入SIRT1和ERK的阻断剂后，与Res+I/R组相比，Res+EX527+I/R组和Res+PD98059+I/R组明显升高(P<0.05)(图1，2)。

2.2 血清中LDH及CK-MB活性

与假手术组比较，各组LDH及CK-MB的活性均增加(P<0.05)。与I/R组相比，Res+I/R组显著降低，PD98059+I/R组显著升高(P<0.05)；与Res+I/R组相比，Res+EX527+I/R组和Res+PD98059+I/R组LDH、CK-MB的活性又回升(P<0.05)(表1)。

2.3 组织GRP78、caspase-12及CHOP mRNA的表达

与假手术组比较，其余各组GRP78、caspase-12及CHOP mRNA的表达量均增加(P<0.05)。与I/R组相比，Res+I/R组显著降低， PD98059+I/R组显著升高(P<0.05)；与Res+I/R组相比，Res+EX527+I/R组及Res+PD98059+I/R组明显升高(P<0.05)(图3)。

图1 各组心肌组织TUNEL染色结果

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group; ΔP<0.05 compared with R+I/R group图2 各组心肌凋亡指数(AI)的变化Fig 2 The changes of apoptosis index of each

groupLDHCK-MBcontrol487±38354±31I/R990±63*877±48*R+I/R602±55#580±54#R+E+I/R724±54Δ720±30ΔR+PD+I/R762±30Δ723±67ΔPD+I/R1155±43#1037±71#

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with I/R group;ΔP<0.05 compared with R+I/R group.

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group; ΔP<0.05 compared with R+I/R group图3 各组内质网应激相关指标GRP78、caspase-12、CHOP mRNA表达的变化Fig 3 The mRNA expression of ERS related marker GRP78, caspase-12 and CHOP of each

2.4 心肌组织caspase-12及CHOP蛋白表达

与假手术组相比，其余各组cleaved-caspase 12 及CHOP蛋白表达量显著增加(P<0.05)。与I/R组相比，Res+I/R组表达量显著降低，PD98059+I/R组表达量升高(P<0.05)；与Res+I/R组相比，Res+EX527+I/R组和Res+PD98059+I/R组均明显升高(P<0.05)(图4)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group;ΔP<0.05 compared with R+I/R group图4 各组心肌caspase-12及CHOP 蛋白表达量的变化Fig 4 The changes of caspase-12 and CHOP protein

2.5 心肌组织SIRT1蛋白表达、磷酸化-ERK1/2与总-ERK1/2蛋白的表达的比值

SIRT1与p-ERK蛋白的表达趋势相同。与I/R组相比SIRT1、p-ERK蛋白表达量较 Res+I/R组显著增加，用SIRT1特异性抑制剂EX527后，两者表达量均降低(图5)。

*P<0.05 compared with control group(Co); #P<0.05 compared with I/R group; ΔP<0.05 compared with R+I/R group图5 各组SIRT1和磷酸化-ERK1/2/总-ERK1/2表达量的变化Fig 5 The SIRT1 protein expression and the ratio of p-ERK1/2 to t-ERK1/2 changes of each

3 讨论

SIRT1能够减轻氧化应激和炎性反应[4]，激活心肌细胞自噬[5]，还能够抑制缺血再灌注所致心肌细胞凋亡[6- 7],保护心肌。白藜芦醇是SIRT1的有效激动剂，而EX527为SIRT1的特异性抑制剂。本结果显示白藜芦醇可降低心肌细胞的凋亡率， EX527可增加凋亡率，表明SIRT1能够有效的抑制细胞凋亡。

近来在被诱导了内质网应激的HepG2细胞中发现SIRT1能够减轻肝细胞内质网应激[8- 9]。心肌缺血再灌注的过程消耗大量的氧气和营养物质，释放大量的氧自由基和炎性因子，也会激活心肌内质网应激相关凋亡途径。本实验运用SIRT1激动剂与抑制剂， 观察在体心肌缺血再灌注时SIRT1对内质网应激相关蛋白表达的影响，发现内质网应激相关因子GRP78、caspase-12和CHOP的mRNA及蛋白表达量随SIRT1的激活而降低，随SIRT1的抑制而升高。Caspase-12和CHOP两条促凋亡通路是内质网相关凋亡的两条重要的途径，caspase-12是内质网特有的促凋亡蛋白酶，当内质网应激发生，无活性的pro-caspase-12被激活后形成cleaved-caspase- 12,继而激活caspsse- 3[10]。CHOP/GADD153是ERS促凋亡的碱性亮氨酸拉链的转录因子，它通过下调凋亡抑制因子Bcl- 2的表达、增加氧化等机制导致细胞凋亡。结果充分表明SIRT1还能够通过抑制内质网应激相关蛋白表达，保护缺血再灌注心肌。

本实验还进一步探索了SIRT1抗内质网应激相关凋亡中ERK1/2的作用。ERK1/2通路是再灌注损伤挽救激酶信号通路(reperfusion injury survival kinase,RISK)之一。心肌缺血再灌注时，磷酸化的ERK1/2能够抑制内质网应激，使心肌细胞凋亡减少，产生心肌保护作用[11]。本实验结果也显示抑制ERK1/2的会增加内质网应激相关蛋白表达，与之前研究相符。有报道SIRT1能促进磷酸化ERK1/2表达增加，对心肌细胞起保护作用[12]，推测ERK1/2信号通路参与了SIRT1对内质网应激相关蛋白表达的作用。因此本实验采用SIRT1的激动剂和抑制剂来观察两者的关系，发现白藜芦醇促进了ERK1/2磷酸化，抑制caspase-12和CHOP的表达，而EX527的作用则相反，说明大鼠心肌缺血再灌注中ERK1/2通路是SIRT1抑制内质网应激相关凋亡的下游靶点之一。综上所述，本结果证实SIRT1能够减轻内质网应激相关凋亡蛋白的表达，并且其机制可能是通过激活ERK1/2通路而实现的。

[1] Minamino T, Komuro I, Kitakaze M,etal. Endoplasmic reticulum stress as a therapeutic target incardiovascular disease[J]. Circ Res, 2010, 107:1071- 1082.

[2] Wu XD, Zhang ZY, Sun S,etal.Hypoxic preconditioning protects microvascular endothelial cells against hypoxia/reoxygenation injury by attenuating endoplasmic reticulum stress[J].Apoptosis, 2013,18:85- 98.

[3] Gan R, Hu G, Zhao Y,etal.Post-conditioning protecting rat cardiomyocytes from apoptosis via attenuating calcium-sensing receptor-induced endo(sarco)plasmic reticulum stress[J]. Mol Cell Biochem,2012,361:123- 134.

[4] Pantazi E, Zaouali MA, Bejaoui M,etal. Role of sirtuins in ischemia-reperfusion injury[J]. World J Gastroenterol,2013,19: 7594- 7602.

[5] Nadtochiy SM, Yao H, McBurney MW,etal. SIRT1-mediated acute cardioprotection[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,301:H1506-H1512.

[6] Liu L, Wang P, Liu X,etal. Exogenous NAD+ supplementation protects H9c2 cardiac myoblasts against hypoxia/reoxygenation injury via Sirt1-p53 pathway[J]. Fundam Clin Pharmacol,2014,28:180- 189.

[7] Pantazi E, Zaouali MA, Bejaoui M,etal. Role of sirtuins in ischemia-reperfusion injury[J]. World J Gastroenterol, 2013,19:7594- 7602.

[8] Lee J, Hong SW, Park SE,etal. Exendin- 4 attenuates endoplasmic reticulum stress through a SIRT1-dependent mechanism[J].Cell Stress Chaperones, 2014,19:649- 656.

[9] Li Y, Xu S, Giles A,etal.Hepatic overexpression of SIRT1 in mice attenuates endoplasmic reticulum stress and insulin resistance in the liver[J]. FASEB J, 2011,25:1664- 1679.

[10] 杨冀萍, 刘怀军,李英,等. NGF抑制兔脑缺血/再灌注损伤时caspase-12的表达[J].基础医学与临床，2007,27：408- 411.

[11] Tao JP, Zhu W,Li YP,etal. Apelin- 13 protects the heart against ischemia-reperfusion injury throughinhibition of ER-dependent apoptotic pathways in a time-dependent fashion[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,301:H1471-H1486.

[12] Becatti M, Taddei N, Cecchi C,etal.SIRT1 modulates MAPK pathways in ischemic-reperfused cardiomyocytes[J].Cell Mol Life Sci, 2012, 69:2245- 2260.

SIRT1 inhibits related protein expression of endoplasmic reticulum stress in myocardial ischemic/reperfusion by activation of ERK1/2 pathway in rat

WU Qian, LIU Xin-wei*

(Dept. of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

Objective To investigate the role of silent information regulator 1 on endoplasmic reticulum dependent apoptosis pathway induced by myocardial ischemic reperfusion and the relationship with ERK1/2 pathway.MethodsRats were divided into 6 groups: control group,ischemic/reperufuison group,resverotrol treatment group, resverotrol plus EX527(1 μg/kg) treatment group, resverotrol (10 mg/kg)plus PD98059 (0.3 mg/kg) treatment group,PD98059 treatment group,each groupn=12.The myocardial I/R injury model in rats was established by ligating left anterior descending coronary artery.TUNEL method was used to detect myocardial apoptosis; Colorimetric method was used to measure LDH and CK-MB activity.qRT-PCR was used to detect the myocardial mRNA expression of GRP78,caspase-12 and CHOP; The protein expression of sirt1,caspase-12,CHOP, phosphor-ERK1/2 and total ERK1/2 were measured by westernblot.Results Compared with I/R group,the myocardial cell apoptosis index,LDH and CK-MB activity,mRNA expression of GRP78,caspase-12,CHOP and the protein expression of caspase-12,CHOP decreased while the protein expression of SIRT1 and phosphor-ERK1/2 increased in resveratrol treatment group.Then treated with SIRT1 inhibitor EX527 in Res+EX+I/R group the increase or decrease result of those index were conteracted compared with Res+I/R group. Conclusions SIRT1 can protect heart from ischemic reperfusion injury through inhibiting ER-dependent apoptosis protein expression,the mechanism of which is partly related with ERK1/2 pathway activation.

SIRT1;myocardil ishcmeic reperfusion injury; endoplasmic reticulum stress;apoptosis;ERK1/2 pathway

2014- 11- 27

2015- 04- 15

国家临床重点专科[财社(2011)170号];重庆市医学重点学科[渝卫科教(2007)2号]，重庆市卫生局医学科研计划重点项目(2012- 1- 022)

1001-6325(2015)06-0761-06

R541

A

*通信作者(corresponding author)：1594390020@qq.com