LIN28B调控miRNAs维持MCF- 7肿瘤干细胞的干性特征

白丽鹏，陈 翀，刘 妍，谢俊岭，王 威，罗云萍

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 免疫学系， 北京 100005)



研究论文

LIN28B调控miRNAs维持MCF- 7肿瘤干细胞的干性特征

白丽鹏，陈 翀，刘 妍，谢俊岭，王 威，罗云萍*

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 免疫学系， 北京 100005)

目的研究LIN28B对人乳腺癌细胞(MCF- 7)肿瘤干细胞的干性状态维持的作用机制。 方法在MCF- 7细胞中瞬时过表达LIN28B，用qPCR和Western blot检测干性相关基因SOX2、NAONG、c-Myc和OCT4的表达；用流式细胞仪检测CD44high/CD24low细胞亚群的比例；利用体外成球培养检测肿瘤干细胞自我更新的能力，通过RNA第二代测序技术检测在LIN28B过表达后MCF- 7细胞中miRNAs的表达差异，通过转染差异表达的miRNA，检测其对MCF- 7细胞肿瘤干细胞比例和体外成球能力的影响。结果转染p-CMV6-LIN28B 后能明显提高LIN28B的mRNA和蛋白水平(P<0.001)；过表达LIN28B后MCF- 7细胞中SOX2、NANOG和OCT4在RNA和蛋白水平表达都明显增高(P<0.05)；CD44high/CD24low细胞比例由1.71%上升至11.60%(P<0.05)；体外成球培养发现成球细胞数量明显增多(P<0.01)；通过RNA测序发现有16个miRNAs在LIN28B过表达后差异表达倍数在2倍以上且P<0.05， LIN28B过表达后miR- 92b- 5p表达显著上调 (P<0.01)； 转染miR- 92b- 5p mimic后MCF- 7细胞的CD44high/CD24low细胞比例由1.14%上升至3.59%(P<0.05)，体外成球能力明显增强(P<0.01)。结论LIN28B能维持MCF- 7肿瘤干细胞的干性状态，其作用机制可能是通过miRNAs的表达来实现的。

LIN28B；肿瘤干细胞；肿瘤相关干性；miRNAs

肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)是肿瘤组织中数量极少具有干细胞特性的细胞，既表现出干细胞的特性又有肿瘤细胞的特点。有研究[1]证明CD44high表型的肺癌细胞比CD44low表型的肺癌细胞有更强的成球能力和致瘤性，接种300个CD44high细胞于NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠就可以形成肿瘤，而接种3×104个CD44low细胞和5×105个未分离的混合细胞都不能形成肿瘤。LIN28是一种首先在线虫C.elegans中发现的RNA结合蛋白，在其发育过程中起重要作用；在哺乳动物中LIN28具有结构和功能高度同源的两种同系物LIN28A和LIN28B。已有研究表明LIN28在多种肿瘤中高表达，与肿瘤的发生、转移密切相关[2- 3]。 miRNA是一类长度为19～24个核苷酸的非编码RNA，通过3′-UTR与靶基因mRNA结合对其进行转录后调控[4]。有研究发现LIN28通过阻止Let- 7的加工成熟影响靶基因的表达，从而对调节细胞代谢、干性发挥重要作用[5- 6]。已有的研究主要是集中在LIN28通过Let- 7发挥的调控作用，不过LIN28也能调控其他miRNAs如miR- 150[3]。本研究主要探究LIN28B对MCF- 7肿瘤干细胞干性特征的调控，并通过miRNA测序发现受LIN28B调控的miRNAs。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人乳腺癌细胞MCF- 7 和DMEM培养基(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；胎牛血清、100×非必需氨基酸及100×青霉素-链霉素(Gibco公司)；人乳腺上皮细胞成球培养基(Stem Cell公司)；低吸附6孔培养板(Corning公司)；辣根过氧化物酶-兔抗人OCT4、SOX2、NANOG、c-Myc和LIN28B(Cell Signaling Technology公司)；流式抗体鼠抗人CD44-APC和CD24-PE(BD公司)；质粒p-CMV6和p-CMV6-LIN28B(Origene公司)；转染试剂Lipo2000及opti-MEM培养基(Invitrogen公司)；第一链cDNA合成试剂盒及qPCR试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 细胞培养及细胞成球培养

人乳腺癌细胞MCF- 7在含10% FBS、1×双抗(青霉素-链霉素溶液) 的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱进行常规培养。待细胞汇合度达80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化并传代；用人乳腺上皮细胞成球培养基将MCF- 7细胞浓度调整为1×104个/ mL，在低吸附6孔培养板中每孔加入2 mL细胞悬液，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中进行成球培养。

1.3 在MCF- 7细胞中瞬时过表达LIN28B

在6孔板中预先铺3×105个细胞，待细胞汇合度达60%～70%时，在对照组和实验组中分别转染质粒p-CMV6和p-CMV6-LIN28B。质粒与lipo2000的比例为1 μg质粒/2 μL lipo2000，分别用250 μL opti-MEM培养基稀释质粒和lipo2000，室温静置5 min，将稀释后的质粒加入稀释后的lipo2000，充分混匀，室温静置20 min。将6孔板细胞上清吸弃，用PBS溶液润洗1次，加入1.5 mL opti-MEM培养基和质粒与lipo2000混合物，培养48 h后提取RNA和蛋白。

1.4 Western blot检测OCT4、SOX2、NAONG、c-Myc和LIN28B的表达

提取细胞总蛋白，使用细胞裂解液，置于冰上5 min，于4 ℃ 14 000×g离心15 min，吸取上清，经12% SDS-PAGE电泳分离，恒流200 mA转膜120 min至PVDF膜，5% BSA封闭1 h，再分别与OCT4、SOX2、NANOG、c-Myc、LIN28B一抗(均为1∶1000稀释，终浓度为1 μg/mL)，4 ℃过夜孵育，洗膜后加入二抗(1∶10 000稀释)，室温孵育1 h，洗膜后用增敏化学发光液显色。

1.5 流式细胞术检测MCF- 7细胞中的干性细胞

分别取6孔板中MCF- 7-NC细胞 和MCF- 7-LIN28B细胞，收集6×105个细胞，用PBS洗涤2次后，加入500 μL染色缓冲液重悬细胞，并分别加入3 μL流式抗体CD44-APC和CD24-PE，4 ℃避光孵育30 min，300×g离心5 min，弃去上清再用PBS溶液洗涤2次，流式细胞仪检测。

1.6 microRNA测序

分别提取MCF- 7-NC细胞和MCF- 7-LIN28B细胞RNA，送华大基因公司测序，质检合格后进行测序，每组送2份样品作为生物学重复。

1.7 RT-qPCR检测干性相关基因及miRNAs的表达

采用Trizol提取RNA，定量后使用反转录试剂盒合成cDNA第一链。使用适量的cDNA作为PCR模板，SYBR染料实时检测扩增产物的量，以β-actin为内参(miRNA qPCR以U6 snRNA为内参)分析基因的表达情况。所使用的引物序列见表1。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 LIN28B促进MCF- 7细胞中干性相关基因的表达

在MCF- 7过表达LIN28B后，与对照组细胞相比，除了LIN28B明显过表达外，干性基因SOX2、NANOG和OCT4在mRNA和蛋白水平也有所增高(P<0.05)，而c-Myc 的表达无明显差异(图1)。

2.2 LIN28B提高MCF- 7干性细胞比例及体外成球能力

过表达LIN28B后，MCF- 7干性细胞即CD44high/CD24low细胞比例由1.71%增高到11.60%(P<0.05)(图2A)；过表达LIN28B后成球细胞的数量和大小都明显高于对照组(P<0.01)(图2B，C)。

2.3 RNA测序

将转染NC-vertor 和LIN28B-vector的MCF- 7细胞提取RNA后测序的热图如下(图3A)，其中差异表达在2倍以上且P<0.05的miRNAs有16个(图3B)；经qPCR验证发现，过表达LIN28B后miR- 92b- 5p表达上调(P<0.01)(图3C)，且与测序结果相符。

表1 qPCR引物序列

2.4 miR- 92b- 5p促进MCF- 7细胞的体外成球能力

在MCF- 7细胞中转染miR- 92b- 5p mimic 48 h后，miR- 92b- 5p的表达明显上调(图4A)， MCF- 7细胞的CD44high/CD24low细胞比例由1.14%上升至3.59% (P<0.05)(图4B)，MCF- 7细胞的体外成球能力明显提高(图4C)。

A.the protein levels of stemness related genes detected by Western blot; B.the relative mRNA levels of stemness related genes detected by qPCR;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with NC-vector

图1 MCF- 7细胞中LIN28B对干性相关基因mRNA及蛋白表达的影响

Fig 1 Effect of LIN28B on expression of stemness related genes mRNA and protein in MCF- 7 cell line

A.the change of proportion of cancer stem cells; B.representative images of tumorsphere cells(×400); C.statistical graph of tumor sphere forming;*P<0.01 compared with NC-vector

图2 LIN28B对MCF- 7肿瘤干细胞的影响

Fig 2 The effect of LIN28B on cancer stem cells in MCF- 7

3 讨论

Lin28是在进化上高度保守的RNA结合蛋白，在机体生长和代谢、组织发育等生物过程发挥重要的作用。既往的研究表明Lin28A和Lin28B主要是通过抑制pri-let- 7加工成成熟的let- 7，促进肿瘤细胞的有氧糖酵解，维持干细胞的未分化状态。CSCs是肿瘤组织中比例很低的、 具有自我更新能力和多向分化潜能的一群细胞，是肿瘤复发、耐药和转移的根源[7]。最新的研究发现SOX2在CSCs致瘤性和放疗耐受性中发挥重要作用[8]；OCT4与CSCs自我更新和分化密切相关[9]，但是干性相关基因LIN28B在CSCs中的作用还不是很清楚。miRNAs作为转录后调控因子，参与一系列重要的生物学过程，如细胞周期、细胞增殖和分化、凋亡和代谢，研究发现miRNAs也参与CSCs自我更新及分化过程。miR- 34a通过Notch信号通路成为早期分裂的结肠癌干细胞(colon cancer stem cells，CCSCs)命运决定因子，通过上调或下调miR- 34a的表达可以改变CCSCs分化和自我更新之间的平衡[10]；通过miRNAs筛选发现，与普通神经干细胞和正常脑组织相比，miR- 340在神经胶质瘤干细胞(glioma-initiating cells，GICs)和神经胶质瘤组织中表达下调，在GICs过表达miR- 340能明显抑制GICs的体外增殖、侵袭和转移能力，使GICs处于失能状态，并抑制GICs在大鼠体内的成瘤能力[11]。本研究通过RNA测序在MCF- 7细胞中找到受LIN28B调控的一些miRNAs，并进一步研究这些miRNAs对CSCs 功能的影响。经qPCR验证发现LIN28B能上调miR- 92b- 5p，转染miR- 92b- 5p mimic后发现能提高MCF- 7细胞的CD44high/CD24low细胞比例，促进MCF- 7细胞的体外成球能力。有研究发现miR- 92b通过调控靶基因RECK促进非小细胞肺癌的肿瘤细胞增殖和迁移[12]，通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭[13]。但LIN28B是如何上调miR- 92b- 5p以及miR- 92b- 5p在LIN28B维持MCF- 7肿瘤干细胞的干性状态过程中的作用有待进一步研究。

A.the result of miRNA sequencing; B.miRNAs of differential expression; C.quantification of differential miRNAs detected by qPCR;*P<0.05,**P<0.01 compared with NC-vector

图3 RNA测序及验证

Fig 3 RNA sequencing and verification

A.the RNA level of miR- 92b- 5p detected by qPCR; B.the change of proportion of cancer stem cells; C.representative images of tumor sphere cells (×400); D.statistical graph of tumor sphere forming;*P<0.05;**P<0.01 compared with NC mimic

图4 miR- 92b- 5p 对MCF- 7肿瘤干细胞的影响

Fig 4 The effect of miR- 92b- 5p on cancer stem cells in MCF- 7

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LIN28B maintains the stemness of cancer stem cells in MCF- 7 cell line via regulating miRNAs

BAI Li-peng, CHEN Chong, LIU Yan, XIE Jun-ling, WANG Wei, LUO Yun-ping*

(Dept. of Immunology, Institute of Basic Medicial Sciences, Chinese Acadermy of Medical Sciences,School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)

Objective To investigate the effect of LIN28B on maintaining the stemness of cancer stem cells in MCF- 7 breast cancer cell line. Methods LIN28B was instantaneously overexpressed in MCF- 7 cells (LIN28B-MCF- 7). The expression of stemness related genes in both mRNA and protein level was detected by either qPCR or Western blot; the proportion of CD44high/CD24lowcells was quantitated by flow cytometry；tumorsphere forming ability was analyzed byinvitroexperiment; the differential expression of miRNAs either in LIN28B overexpression cells or wild type cells was detected by miRNA-sequencing or real-time PCR. The ability of tumorspheres forming was detected after transfecting miRNA mimics. Results The expression of LIN28B significantly increased in MCF-7 cells that transfected p-CMV6-LIN28B (P<0.001). The expression of either mRNA and protein of SOX2, NANOG, c-Myc and OCT4 were up-regulated (P<0.05); the proportion of CD44high/CD24lowcells increased from 1.71% to 11.60% (P<0.05); the number of tumorspheres was significantly improved (P<0.01) in LIN28B-MCF- 7 cells; 16 miRNAs of differential expression were found by miRNA-sequencing in LIN28B-MCF- 7 cells comparing to wild type cells. The proportion of CD44high/CD24lowcells was increased from 1.14% to 3.59% (P<0.05), and the ability of tumorsphere forming was significantly increased in MCF- 7 cells after transfecting miR- 92b- 5p mimic (P<0.01). Conclusions LIN28B keeps the stemness of cancer stem cells by regulating miRNAs in MCF- 7 cell line.

LIN28B；cancer stem cells；tumor associated stemness；miRNAs

2015- 03- 12

2015- 04- 15

国家重点基础研究发展计划(2013CB967202)

1001-6325(2015)06-0754-07

R73-354

A

*通信作者(corresponding author)：ypluo@ibms.pumc.edu.cn