溃疡性结肠炎大鼠肠紧密连接occludin蛋白表达降低及药物的影响

胡红卫，熊晶晶，赵 川，远孟梦，魏 来，刘 梅，黄永坤*，赵亚玲，丁臻博

(昆明医科大学第一附属医院 1.儿科； 2.病理科， 云南 昆明 650032)



溃疡性结肠炎大鼠肠紧密连接occludin蛋白表达降低及药物的影响

胡红卫1#，熊晶晶1#，赵 川2，远孟梦1，魏 来1，刘 梅1，黄永坤1*，赵亚玲1，丁臻博1

(昆明医科大学第一附属医院 1.儿科； 2.病理科， 云南 昆明 650032)

炎症性肠病是慢性且易反复发作的胃肠道病症，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。Occludin蛋白是肠紧密连接中最重要的蛋白质分子之一，表达上调，可以减少肠上皮受损，保护肠黏膜上皮间的紧密连接蛋白，降低肠道通透性[1]。美沙拉秦因其疗效好及不良反应较少而作为溃疡性结肠炎的一线治疗药，但仍可见其不良反应。蒙脱石散是良好的肠黏膜保护剂，参与肠黏膜的直接修复作用。本研究测定肠紧密连接occludin蛋白，拟评价美沙拉秦和蒙脱石散单独或联合治疗TNBS/乙醇诱导的溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜变化，以深入认识肠黏膜屏障损伤和修复机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象:50只清洁级SD雄性大鼠，体质量160～180 g，6～8周[昆明医科大学动物实验中心(合格证号：SYSK(滇)2011- 0004)]。

1.2 主要试剂:2- 4- 6三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司)，美沙拉秦肠溶片(Losan Pharma.GmbH公司)，蒙脱石散(规格3 g/袋，博福-益普生公司)，RNA反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒(天根生化公司)；兔抗大鼠occludin抗体(Abcam公司)。

1.3 主要实验方法

1.3.1 分组及造模:将大鼠随机分为对照组(A组)、模型组(B组)、美沙拉秦组(C组)、蒙脱石散组(D组)和美沙拉秦联合蒙脱石散组(E组)，每组n=10。参照文献[2]造模。造模满24 h随机抽取1～2只大鼠行解剖及光电镜检查证实造模成功。根据人和大鼠体表面积换算公式予各组相应的药物剂量，模型组给予0.9%氯化钠溶液2 mL。

1.3.2 疾病活动指数(DAI)评分:造模满24 h开始每天观察并记录大鼠的精神、体质量和大便情况。

1.3.3 标本采集:治疗满12 d时取病变最明显处肠组织，一部分行HE染色及免疫组织化学法检测肠紧密连接occludin蛋白的表达。另一部分行实时荧光定量PCR法检测肠紧密连接occludin-mRNA的表达。

1.3.4 结肠组织病理学评价:行HE染色的结肠组织于光镜和电镜下观察病理改变。

1.3.5 免疫组织化学染色检测肠紧密连接蛋白occludin:采用Elivision法检测肠紧密连接occludin蛋白。高倍镜下随机选取3个视野，参照Fromowitz半定量分级方法对组织评分。

1.3.6 实时荧光定量PCR法检测肠紧密连接蛋白occludin-mRNA，occludin引物序列：上游5′-CGGGCTACCTTATTGAA TGTCC-3′，下游5′-GAGCGAACTGAATGGTCTGATG-3′；按照试剂盒说明进行RNA的提取，反转录合成cDNA，取1 μL cDNA用于反应。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 31 s，45个循环数。以大鼠GAPDH为内参，运用2-△△ct法进行计算，每次每个样本重复3次。

2 结果

2.1 模型建立成功:造模满24 h，大鼠死亡1只。余大鼠出现体质量下降，腹泻和黏液血便。DAI评分为2.6～3分。在光镜和电镜下造模满24 h大鼠结肠黏膜层缺血、坏死，溃疡形成面积大，黏膜下层水肿，腺体结构破坏，杯状细胞减少。模型建立成功(图1，2)。

2.2 治疗12 d以后免疫组化结果及real time PCR结果

3 讨论

Occludin蛋白是第一个被发现的定位于紧密连接的跨膜蛋白， 在肠紧密连接屏障中发挥重要作用。肠occludin蛋白表达的降低是导致肠上皮紧密连接通透性增加的重要机制[3]。在溃疡性结肠炎模型大鼠中，肠occludin蛋白表达明显降低。蒙脱石散有直接修复肠黏膜的作用，由此联合使用美沙拉秦和蒙脱石散治疗大鼠溃疡性结肠炎模型。通过实验发现联合用药使occludin蛋白的表达较单独使用明显升高。其可能机制一方面是由于美沙拉秦作为非特异性抗炎药减弱了相应的炎性因子所激活的免疫反应。但同时美沙拉秦作为抗炎药单纯发挥抑制炎性反应的作用，而不能有效改善肠内触发炎性反应的微环境。蒙脱石散有效覆盖在肠黏膜上，发挥直接修复肠黏膜的作用，同时吸附有害毒素，减少抗原物质对细胞膜表面Toll样受体及NOD样受体的刺激，抑制NF-κB转录因子的活化而下调促炎因子。综上美沙拉秦联合蒙脱石散治疗UC时，发挥了保护和促进肠黏膜修复的效果。

图1 对照组和模型组光镜组织嗜伊红染色Fig 1 Light microscope HE of control and model group(×80)

图2 对照组和模型组电镜的组织结构Fig 2 Electric microscope histological structures of control and model group

groupoccludin-mRNA/(×10-4)occludinproteinA8.97±4.330.72±0.17#B6.79±1.350.26±0.20*C17.64±4.83*#0.40±0.26*D13.74±2.61*#0.34±0.17*E28.76±4.50*#0.78±0.14#

*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with B group.

[1] 张文远,姜伟炜.白头翁醇提物对大鼠结肠炎肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白的保护作用[J].世界华人消化杂志,2009,17:3134- 3139.

[2] 孙晓萍,候丽娟,王晓红,等.大鼠慢性溃疡性结肠炎模型的建立及操作规范探讨[J].天津中医药2012,29:270- 273.

[3] Rana AS,Khaldun K,Guo SH,etal.Occludin regulates macromolecule flux across the intestinal epithelial tight junction barrier[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2011,300:G1054-G1064.

2015- 03- 13

2015- 05- 26

“十二五”云南省特色学科群建设项目(201109)；益普生腹泻基金(IDF- 2012- 01)

1001-6325(2015)11-1540-02

R573.9

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*通信作者(corresponding author)：13577097854@163.com

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