临床生化综合性实验——肥胖大鼠血糖血脂的检测

李 姣,方小楠,胡安南,吕立夏,徐 磊,徐国彤

(同济大学医学院 生物化学与分子生物学教研室,上海 200092)

临床生化综合性实验
——肥胖大鼠血糖血脂的检测

李 姣,方小楠,胡安南,吕立夏,徐 磊,徐国彤

(同济大学医学院 生物化学与分子生物学教研室,上海 200092)

针对二年级的医学生,结合与物质代谢相关的临床疾病——肥胖及糖尿病,将原有临床生化实验重新调整,设计成一组综合性实验,通过构建营养型肥胖大鼠模型,使学生通过实验观察正常和肥胖大鼠血糖水平、血浆脂蛋白成分的变化，以及2组大鼠对胰岛素的敏感性。结合理论课糖类和脂类代谢的内容,激发学生对于疾病的思考,更好地理解代谢异常所导致疾病的发病机制,为将来的临床应用打下基础。

临床生化实验;营养型肥胖;血糖;血脂;胰岛素

血糖和血脂的检测是临床生化实验的主要内容。这部分实验主要涉及生物化学理论课糖类和脂类代谢的知识,临床上常见的糖尿病、高脂血症及相关的高血压、动脉粥样硬化都与这部分内容紧密相关。以往的实践中,血糖和血脂的检测是分别放在2个不同的实验,血糖检测中只观察了胰岛素的降血糖效应,血脂检测中只进行了脂蛋白电泳,学生对于肥胖疾病模型的构建和相应代谢指标的变化并没有整体和系统的了解。针对上述不足,将实验重新调整,将其设计成相对完整的综合性的临床生化实验。本实验改革已在医学本科生教学中连续应用2年。

1 实验目的

在实验中,学生首先观察到部分进食高脂饮食的大鼠体重明显大于正常饮食大鼠,并将大鼠分成对照组和肥胖组;接下来剪尾取血检测2组大鼠的血糖和进行胰岛素的敏感度实验;同时将2组大鼠的血浆进行脂蛋白电泳观察脂蛋白成分的变化;最后汇总数据进行分析讨论。通过参与整个实验,学生对肥胖及其相关的血糖和血脂代谢异常印象深刻,加深了对理论课内容的理解和记忆,同时激发了对于疾病发病机制的思考,为医学生将来的临床实践和应用打下良好基础。

目前的研究表明,肥胖与糖尿病、高脂血症及相关的高血压、动脉粥样硬化等疾病的发病密切相关[1-2](见图1),其发病机制主要是由于脂肪组织所产生的细胞因子所致。脂肪组织不仅是能量储存器官,还是机体重要的内分泌器官,可产生多种激素和因子,如瘦素(leptin)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、脂联素、内脂素、抵抗素、白细胞介素-6等,统称为脂肪细胞因子[3-5]。这些因子对机体的物质能量代谢及其调节有重要影响[6-7],肥胖时脂肪细胞因子表达发生变化,其中脂联素是目前最明确和最重要的一个具有抗胰岛素抵抗作用的脂肪细胞因子,参与糖、脂的代谢,体重增加时血清脂联素水平明显降低,而瘦素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6等水平增高,结合其他相关因子的相互作用进而导致葡萄糖耐量异常、高脂血症、糖尿病和视网膜病等一系列疾病的发生。

图1 肥胖与很多疾病相关

糖类代谢和脂类代谢是医学生生物化学物质代谢章节的主要内容,其代谢异常是导致临床很多疾病的发病原因。为使学生更好地理解理论知识并联系临床应用,同时提高学生学习的兴趣,将临床生化检测实验设计成相对连续完整的从肥胖模型建立到血糖血脂检测的综合设计性实验,使学生能够观察疾病的发生发展,在实践中激发对疾病发病机制的思考。

2 实验课程基本流程

本实验内容是二年级医学生“生命科学综合实验Ⅰ”课程中9个实验当中的一个。本实验一共6个学时,每班有16个学生,2个学生一组。成绩由3部分组成:笔试 (30%)、实验报告(50%)、操作表现和出勤(20%)。表1为实验安排。

表1 临床生化实验安排

2.1 实践 1: 大鼠称重和喂养

成年雄性SD大鼠购于上海斯莱克实验动物公司。每组2个学生操作1只大鼠,每班有12只大鼠,多出的大鼠留作备用(以备死亡或肥胖抵抗)。本实验的目的是建立肥胖大鼠模型,进而检测肥胖大鼠和对照大鼠的血糖、血脂和胰岛素调节情况。

随机将大鼠分成对照组和高脂饮食组,喂养4周。大鼠饲养在医学院动物中心,由专门的技术人员每天照看。高脂饮食谱:正常饮食 60.7 %,猪油 12 %,蔗糖 8 %,全脂奶粉5 %,胆固醇2 %,蛋黄粉 10 %,胆盐0.3 %,盐2 %[8]。

4周喂养结束,每班学生对大鼠称重。对照组和高脂组各选4只进行后继实验。高脂组中选取体重超过对照20%的大鼠。大鼠体重比较见表2。8只大鼠分别进行标记,并在实验前一天禁食12 h。整个学生的实验操作在实验教学中心的学生实验室进行。

表2 对照和高脂组大鼠体重比较

注: 1.体重:喂养4周后体重;2.*P<0.01 与对照组比较

2.2 实践 2: 血糖检测,胰岛素耐量实验,脂蛋白电泳

整个检测可分成3部分。

第一部分:

教师首先对本次检测的原理和操作做一详细的阐述。本次授课最大的特色在于给学生演示胰岛素注射和剪尾取血的视频,本视频由经验丰富的教师担任主角,以简洁、轻松并带幽默的方式示教,使艰苦的工作有个轻松的开始。

第二部分:

首先剪尾取血:将鼠尾在45 ℃温水中浸泡数min,擦干鼠尾,将尾尖剪去5 mm(大鼠)。从尾根部向尾尖部按摩,血即从断端流出,让血液滴入试管。取血后,用棉球压迫止血,保护伤口。接下来注射激素与后继采血:皮下或腹腔内注射胰岛素,0.75 IU/kg(60 U/kg),分别在30,60,90和120 min后取血0.2～0.3 mL,标明胰1-4。3 000 r/min离心5 min,分离血清。加入抗凝剂时,3 000 r/min离心5 min,分离血浆。

第三部分:

(1) 血糖测定。葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法),见表3。将样品置37 ℃水浴 10 min,用波长 505 nm,空白管调“零”点测定各管的吸光度(A)值。

(2) 预染血清(血浆)。各处理组血清0.2 mL中加入苏丹黑B染色液0.02 ml,混匀后置42oC水浴30 min,离心(2 000 r/min)5 min。

(3) 电泳。预染血清样品近负极端,接通电源,电压100～120 V，电泳约45 min。学生记录数据并拍照。

表3 血糖测定葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法) μL

2.3 实践 3: 数据分析和讨论

学生制作PPT,显示数据,进行分析讨论。数据见表4和图2。从上述2个主要的结果可以看到,肥胖组大鼠的空腹血糖与对照组相比有升高,而且对胰岛素降血糖的敏感度也低于对照组;血浆脂蛋白电泳结果中,高脂组的低密度脂蛋白(LDL)含量与对照组相比增加。

表4 空腹血糖的比较

注:*P<0.01 与对照组比较。

图2 胰岛素耐量实验

3 讨论

建立疾病动物模型是研究疾病的常用方法。建立肥胖大鼠模型的技术比较成熟易操作,并且重复性也较好[9-12]。本实验课程从造模到检测再到数据分析讨论,学生通过整个流程对疾病的研究方法和代谢变化有了一个基本的认识和体会。

在第一步中,学生首先对成年大鼠进行称重,在教师的指导下,学生对大鼠的一些基本习性和抓取方法有一个简单了解,并对大鼠的大小有一个直观的认识,加深对大鼠生长,尤其是高脂饮食组体重增长明显的直观印象。通过观察,学生在最后的讨论中意识到饮食结构能够明显地影响体重。

在第二步中,教师制作的视频简短而轻松,学生都能够认真观看并印象颇深,接下来在教师的指导下通过激素注射和反复的剪尾取血,可以看到每小组2个学生的操作越来越熟练，并且合作也越来越默契,大大提高了学生的动手能力。通过离心观察到与正常饮食大鼠血浆相比,有2只高脂饮食大鼠的血浆明显变得浑浊,从而加深对高脂饮食影响体内代谢的直观认识。

接下来通过对血糖血脂的检测进一步认识到高脂饮食会导致血糖的升高和对胰岛素降血糖调节的抵抗。

在第三步的讨论中,学生已经对高脂饮食对机体造成的影响有了比较清晰的认识,并且联系自身的生活习惯，提高了预防疾病的意识,同时教师联系学生所学生化理论知识和临床疾病,如Ⅱ型糖尿病和高脂血症进行总结性讲解,进一步加强了学生对所学生化基础知识的临床应用。

4 结束语

通过本实验,学生提高了动手能力、增强了团队意识,并且将所学的生化知识应用于生活和临床。本实验适合作为设计性临床生化实验推广应用。

References)

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Integrated experiment-clinical biochemistry determination of obese rat’s blood glucose and lipoprotein

Li Jiao,Fang Xiaonan,Hu Annan,Lü Lixia,Xu Lei,Xu Guotong

(Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Medicine,Tongji University,Shanghai 200092,China)

For Grad 2 medical students,this paper puts forward to redesign the original experiment and develop a relatively integral clinical biochemistry experiment. During experimental period, the students observe obesity resulted from high fat diet,abnormal insulin tolerance and lipoprotein content change in obese rat. The students are not only exposed to techniques and equipment but also inspired to think more about disease. Associated with lecture topics about metabolism of carbohydrates and lipids,the students get a better understanding about relevance of carbohydrates and lipid metabolism to related disease. It can lay a profound foundation for medical student’s clinical application.

clinical biochemistry experiment;nutritional obesity;blood glucose;blood lipoprotein;insulin

2014- 05- 12 修改日期：2014- 07- 18

同济大学实验教学改革第6期项目“激素和饮食对大鼠糖类和脂类代谢的影响”

李姣(1977—),女,辽宁沈阳,博士,讲师,生物化学与分子生物学专业

吕立夏(1969—),女,河南，博士,副教授,研究方向为干细胞分子生物学.

E-mail：li2sister@163.com

G642.423

A

1002-4956(2015)1- 0185- 03