辽宁省脊髓灰质炎实验室细胞敏感性实验方法的建立与应用

段亚彤 任丽萍 韩悦

辽宁省脊髓灰质炎实验室细胞敏感性实验方法的建立与应用

段亚彤 任丽萍 韩悦

目的 制备辽宁省疾病预防控制中心脊髓灰质炎(脊灰)实验室质量控制标准毒株(QC),评价辽宁省脊灰实验室所用细胞系对脊灰病毒的敏感性,为脊灰实验室常规监测工作提供可靠质量保证。方法 采用96孔微量培养板滴定法。结果 辽宁省脊灰实验室2013年制备的QC 3次独立的细胞敏感性实验结果的滴度波动在±0.5 log 10 CCID50以内，同时用中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家脊灰实验室提供的已知滴度的Sabin参考株(CSTRS)做平行对照，CSTRS原始株3次滴度结果与其本身提供的参考值相比较，其滴度波动均在±0.5 log 10 CCID50范围内。开展的9次常规细胞系敏感性实验，结果也均在正常范围内。结论 辽宁省脊灰实验室QC结果符合实验要求，辽宁省脊灰实验室所用细胞系对脊灰病毒的敏感性未下降,是敏感、有效的。

脊髓灰质炎病毒;细胞系敏感性实验;质量控制标准株（QC）

按照世界卫生组织(WHO)要求，全球脊髓灰质炎(脊灰)实验室网络应开展细胞系敏感性实验，以保持病毒分离过程中的高度敏感性，维持实验室网络的高质量运转[1]。辽宁省脊灰实验室按照国家脊灰实验室要求逐步将细胞敏感性监测纳入常规监测内容，2013年重新制备了我省脊灰实验室质量控制标准毒株（QC），用于RD(来源于人横纹肌肉瘤细胞)、L 20 B(来源于转基因小鼠肺细胞，表达了人类脊灰受体)细胞系细胞敏感性评价。

1 材料与方法

1.1 毒株的选择 标准Sabin脊灰病毒参考株由国家脊灰实验室提供,每管0.8 mL,低温运输,-80℃保存。

1.2 细胞 无支原体污染的合格RD及L 20 B细胞系由国家脊灰实验室提供。

1.3 实验方法 采用96孔微量培养板滴定法。

1.3.1 制备辽宁省脊灰实验室质量控制的标准毒株。

(1)检查细胞质量，通过视觉确定有无污染，将长满单层健康的RD及L 20 B细胞（传代后至少培养了2 d）换维持液并标记。

(2)在生物安全柜中进行操作，每次只能操作1种血清型的病毒。先将1管CSTRS脊灰病毒参考株用无菌吸管混匀，吸一半内容物(约0.4 mL)接种于准备好的RD细胞培养瓶中，剩下的一半接种于准备好的L 20 B细胞培养瓶中，接种后的培养瓶置于36℃恒温培养。

(3)逐日观察并记录细胞病变(CPE)。当75%～100%细胞出现CPE时，将培养瓶反复冻融3次（解冻时摇动细胞瓶以确保所有细胞都能从瓶壁上脱落下来）。

(4)在生物安全柜中，用10 mL无菌吸管混匀培养瓶中的内容物，并吸至标记好的50 mL无菌离心管中。确保离心机盖子和离心杯密封好后，将其置于冷冻离心机中(3000 rpm／min)，离心20 min。

(5)每个保存管标记好所用的细胞名称、制备的病毒型别和冻存日期等。在生物安全柜中，将上清液每管0.1 mL分装在标记好的保存管中。

(6)将保存管冻存于指定的用于保存感染性物质的-80℃冰箱，作为辽宁省脊灰实验室质量控制的标准毒株（QC）。

1.3.2 细胞系敏感性实验 按照《脊髓灰质炎手册》的方法和要求进行[2],通过Karber公式计算病毒滴度[3-5]。

1.3.3 QC滴度确定 制备的QC进行了3次独立的滴度水平测定,同时用CSTRS参考标准株作平行实验，要保证有100%CPE及＜10%CPE出现的稀释度。CSTRS参考株3次滴度结果与其本身提供的参考值相比较,其滴度波动均在±0.5 log 10 CCID50以内，QC的滴度要高于CSTRS参考标准株,且3次QC实验结果的滴度波动不超过±0.5 log 10 CCID50，表明QC滴度结果有效。如符合上述要求，取3次QC滴度结果的平均值做为QC标准值。

1.3.4 细胞支原体检测 应用PCR法检测细胞系支原体，引物由国家脊灰实验室提供；核酸提取试剂盒:QIAGEN RNeasy Mini Kit；扩增条件：94℃3 min；94℃30 s、50℃30 s、72℃1 min 20 s，35个循环；72℃10 min。

2 结果

2.1 CSTRS参考标准株滴度 SabinI：在RD细胞上为5.00log10CCID50/0.1mL，在L20B细胞上为4.78log 10CCID50/ 0.1mL。SabinII：在RD细胞上为5.00log10CCID50/0.1mL，在L 20B细胞上为4.82log10CCID50/0.1mL。SabinIII：在RD细胞上为5.00log10 CCID50/0.1mL，在L20B细胞上为4.77log 10CCID50/0.1mL。见表1。

2.2 辽宁省脊灰实验室QC滴度参考值 SabinI：在RD细胞上为8.33 log 10 CCID50/0.1 mL，在L 20 B细胞上为7.95 log 10 CCID50/0.1 mL。SabinII：在RD细胞为8.17 log 10 CCID50/0.1 mL，在L 20 B细胞上为8.07 log 10 CCID50/ 0.1 mL。SabinIII：在RD细胞上为8.53 log 10 CCID50/0.1 mL，在L 20 B细胞上为7.38 log 10 CCID50／0.1 mL。见表2。

表1 QC滴度确定

表2 实验用细胞代数

2.3 3L 20 B及RD细胞的支原体检测和细胞敏感性实验2013年4月～到2015年8月共进行9次细胞敏感性实验，实验结果均在合格范围内，支原体检测均为阴性。见表3。

3 讨论

虽然我国自2000年证实无脊灰状态，但仍面临野毒输入的风险[6-7]。按照卫生部和国家脊灰实验室要求，脊灰病毒实验室检测与结果报告的时限由原来的28天缩短为14天,因此使用高敏感的细胞系对脊灰病毒分离尤为重要。细胞是病毒分离的工具,支原体污染细胞后通过多种机制影响细胞的生长,从而影响细胞的敏感性[8]。辽宁省脊灰实验室逐步将细胞敏感性实验纳入了常规监测中，2013年制备了新一批本实验室的QC并同时开展了细胞系的支原体检测，实验结果显示用CSTRS参考标准株做平行实验，3次实验结果滴度均波动在±0.5 log 10 CCID50范围内，QC的滴度高于CSTRS参考标准株,3次QC实验结果的滴度波动均在±0.5 log 10 CCID50范围内，因此可以确定本实验室QC滴度结果的有效性，取3次QC滴度的平均值做为辽宁省脊灰实验室QC标准值。制定并确定辽宁省脊灰实验室QC滴度后做的9次细胞敏感性实验结果均在正常范围内且通过PCR法对RD和L 20 B细胞的支原体检测均为阴性，表明辽宁省脊灰实验室所使用的细胞对脊灰病毒保持着正常的敏感性，为辽宁省脊灰实验室的监测工作提供了可靠的技术保障。

表3 支原体检测及细胞敏感性实验结果

[1] 王东艳，赵蓉，安洪秋.脊髓灰质炎病毒细胞系敏感性实验方法的建立[J].中国计划免疫,2005,11(6)：431-434．

[2] 世界卫生组织．脊髓灰质炎手册[M]．4版．北京：人民卫生出版社,2004：71-77．

[3] 冷红英，吴 昀，胡莹.江苏省脊髓灰质炎实验室细胞系敏感性实验方法的建立和监测[J].中国初级卫生保健,2014,28(1):77-78.

[4] 陈玫，宋慧军，郭玉.河北省脊髓灰质炎实验室细胞系敏感性实验方法的建立[J].预防医学情报杂志,2006,22(3）:267-269.

[5] 陈玫，赵娜，张俊棉.2006-2011年河北省脊髓灰质炎实验室细胞敏感性监测结果分析[J].预防医学情报杂志,2013,29(7):569-571.

[6] 汪海波，罗会明，温宁.全球脊髓灰质炎流行情况分析及对我国防范脊髓灰质炎野病毒输入对策的启示[J].中国疫苗和免疫, 2012,18(1):81-85.

[7] 张肖肖，路明，霞马.河南省脊髓灰质炎野病毒输入与传播风险评估[J].当代医学，2012,18(26):155-158.

[8] 严冬梅,张勇,王东艳.浅析支原体污染对非脊髓灰质炎肠道病毒分离率的影响[J].中国计划免疫,2004,10(6)：329-332．

Objective To prepare the quality control standard strain (QC) of Liaoning Provincial polio laboratory(LNPPL), to evaluate the sensitivity of the cell line to the polio virus in LNPPL, and to provide reliable quality assurance for the routine monitoring of the polio laboratory. Methods 96-microwells plate'S culture and titration was used. Results In the Qc of LNPPL,the fluctuation of titre was±0．.5 log 10 CCID50in 3 independent cellular sensitivity tests．At the sametime, China Sabin Test Reference Strain(CSTRS)provided by the National Polio Laboratory in viral disease control and preventionstation in the National CDC was used as parallel contrast．The fluctuation of titre were also±0．5 log 10 CCID50in 3 independent cellularsensitivity test comparing with its own standard provided by CSTRS．The results were also within the normal range of 9 conventional cell line sensitivity test. Conclusion The result of Qc in LNPPL was in accordance withexperimental requirement．And the sensitivity of the cell line to poliovirus used in LNPPL was not dropping，which was sensitive andefective．

Polio virus; Cell line sensitivity test; Quality control standard strain (QC)

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.36.006

辽宁 110005 辽宁省疾病预防控制中心免疫规划所（段亚彤 任丽萍 韩悦）