重组溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK的构建和体内、外抑杀瘤作用的实验研究

高云东 李晶玉 刘进 尹桂华 宋玉国 王翠霞

重组溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK的构建和体内、外抑杀瘤作用的实验研究

高云东 李晶玉 刘进 尹桂华 宋玉国 王翠霞

目的 构建重组溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK，并研究其在体内、体外杀瘤作用的应用。方法 选取2011年2月～2013年12月北华大学附属医院收治的卵巢癌患者100例，随机均分为治疗组与对照组（n=50），治疗组采取患者的癌症细胞SKOV3细胞，将病毒质粒经介质传染给癌症细胞并进行PCR体外扩增，经紫外线分光光度法检测病毒颗粒浓度，以TCID50法检测感染性滴度，并计算病毒比活性，保证植入的病毒含有E1A基因片段；对照组患者进行体内植入重组溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK，观察抑制杀瘤疗效。结果 经PCR体外扩增，得到DNA片段，进行凝胶电泳，可知植入的重组溶瘤腺病毒含有E1A基因片段。通过紫外线分光光度法测得治疗组病毒颗粒浓度比上测得的感染性滴度得到病毒比活性为3.56%，显著高于对照组2.01%（P＜0.05）。进行体外抑瘤实验中，治疗组注入病毒成分为rAd-E1A-CDglyTK，其对SKOV3细胞的生长抑制率为（16.59±1.57），显著高于含有rAd-CDglyTK的对照组生长抑制率（10.80±1.47）（P＜0.05）。体内抑瘤实验中，治疗组生长抑制率为（26.12±8.11），显著高于对照组（1.69±4.12），差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 重组溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK具有较好的抑制杀瘤作用，其中体内杀瘤强于体外杀瘤，疗效显著，值得推广使用。

重组溶瘤腺病毒；rAd-E1A-CDglyTK；体内；体外

腺病毒是一类DNA病毒，人体共有约50余种腺病毒，该病毒对人体没有致癌性，长度约为20～40个碱基对[1]。肿瘤由肿瘤细胞构成，形态大小不一，危害程度不等，分为良性肿瘤与恶性肿瘤，为临床上常发疾病之一，渐渐成为困扰人们生活健康的罪魁祸首，受到医学界的高度重视[2]。而溶瘤腺病毒是一种具有复制能力并且能够抑制杀害肿瘤的杀伤性病毒，目前，通过运用溶瘤腺病毒的方式消灭肿瘤在医学上较为常见，其理论与实践技术也逐渐成熟[3]。本研究分析100例患者临床资料，探讨重组溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK在体内、体外杀瘤作用的应用疗效与价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年2月～2013年12月北华大学附属医院收治的卵巢癌患者100例，保证患者具有大致相同既往病史,随机均分为治疗组与对照组（n=50）。其中治疗组中男27例，女23例，年龄44～65岁，平均年龄（54.5±5.5）岁；对照组中男24例，女26例，年龄46～63岁，平均年龄（54.5±5.5）岁。2组患者在年龄、病史等一般资料方面差异均无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 仪器 本次实验的仪器包括PCR仪器由长春博研科学仪器有限责任公司提供；凝胶电泳仪器由长春博讯提供；分光光度紫外线仪器与TCID检测仪由长春博讯提供。高度离心机由长春博研科学仪器有限责任公司提供。冷冻离心机、高速冷冻离心机、超速冷冻离心机由北京科学仪器有限责任公司提供。电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜成像系统由上海仪器有限责任公司提供。

1.2.2 实验方法 （1）PCR扩增：聚合酶链反应，1个周期由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成。其中退火温度控制在70℃左右，标准反应体系操作，即包含缓冲剂Mg2+1.5mmol/L，模板DNA 0.1～2μg，引物各10～100pmol，4种dNTP混合物各200μmol/L及10×扩增缓冲液10μL。其中PCR弓I物：由Takara公司合成。

E1A上游引物：5’-GAAGATCTTAGAGTTTTCTCCTC CG-3’

E1A下游引物：5’-AGGGAGAGGGGCGGAATTGGCCG CCCTCACACACGCAATCACAGGTnACACC-3’

CDglyTK上游引物：5’-CCGCTCGAGAGGCTAACAAT GTCGAAT-3’

CDglyTK下游引物：5’-GCTCTAGATCAGTTAGCCTC CCCCATCT-3’

（2）紫外线分光光度法：取待测液装入干净的1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率。

（3）TCID50测定。

（4）凝胶成像，荧光成像。

1.3 观察指标 （1）根据PCR进行DNA重组扩增，凝胶电泳成像观察，与可知物对比，得到待测物所含基因片段。（2)通过分光光度法，朗伯比尔定律，当单色辐射照射到吸收层厚度为b，浓度为c的吸光物质时，辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层的厚度。测得待测物基因片段。（3)病毒比活性为病毒颗粒浓度与感染性浓度的比值，反映病毒中含酶制剂的纯度。（4）生长抑制率指对其生长抑制的能力，同未包含rAd-E1A-CDglyTK病毒的对照组相比对SKOV3肿瘤细胞的生长抑制率。

1.4 统计学方法 对本组研究的数据采用SPSS15.0统计软件进行分析。正态计量资料采用“x±s”表示，2组正态计量数据的组间比较采用t检验；计数资料用例数（n）表示，计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组病毒比活性比较 2组患者经紫外线分光光度法与TCID50测定后，可计算病毒比活。含有rAd-E1ACDglyTK的治疗组病毒比活为3.34%，显著高于含有rAd-CDglyTK的对照组（2.01%），治疗组病毒具有较高酶纯度。2组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 患者的CMI得分比较（%）

2.2 患者对SKOV3细胞的生长抑制率比较 经比较分析后，无论体内抑制还是体外抑制，治疗组生长抑制率均显著高于对照组。2组数据比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

肿瘤是临床上常见的疾病之一，大小不一，发病原因与位置同样不可确定，肿瘤分为良性肿瘤与恶心肿瘤，随着时代的发展、医学的进步，对肿瘤的治疗已不仅局限于简单的用药治疗与外科手术治疗[4]，通过溶瘤病毒抑制杀害肿瘤的方式已逐渐成熟并效果显著[5]。腺病毒在人体内含量较多，且无致病性，因此可用于溶瘤病毒的重组[6]。其中，我国应用重组溶瘤腺病毒的方式来抑制杀害肿瘤兴起于20世纪90年代，随着科技的进步，我国对该种治疗方式的研究小有成效。此外，国内外学者对重组溶瘤腺病毒及肿瘤治疗的研究也逐渐发展与成熟。对于肿瘤患者的治疗不能仅依靠医生的精湛技艺以及高端仪器的先进技术，同时需要研发高效、无害、简易方便的溶瘤病毒技术[7-8]。经本实验可知，通过PCR扩增及分光光度法可测得在经PCR体外扩增，得到DNA片段，进行凝胶电泳，可知植入的重组溶瘤腺病毒含有E1A基因片段。同时通过紫外线分光光度法测得治疗组病毒颗粒浓度比上测得的感染性滴度得到病毒比活性为3.56%，显著高于对照组2.01%（P＜0.05），表明重组溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK具有更高纯度的酶制剂，其活性更强。在体外体内抑制肿瘤实验中，治疗组中对SKOV3肿瘤细胞的生长抑制率分别为（16.59±1.57）%与（26.12±8.11）%，显著高于对照组[（10.80±1.47）%与（1.69±4.12）%](P＜0.05)，表明重组溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK对于肿瘤的抑制杀害具有较好的疗效。

表2 2组患者的肿瘤抑制率比较（x±s）

综上所述，重组溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK具有较好的抑制杀瘤作用，其中体内杀瘤强于体外杀瘤，疗效显著，值得广泛应用及推广。

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[2] 孙立臣.双靶向溶瘤腺病毒携带内皮抑素基因对肝癌的抑制作用[J].中华实验外科杂志，2012，29（8）：1529-1531．

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Objective To build recombinant adenovirus soluble tumor rAd-E1A-CDglyTK, and to study the application of the in vivo and in vitro killing tumor effect. Methods 100 cases of patients with ovarian cancer randomly divided into the treatment group and the control group, 50 cases in each group, the treatment group was taken the patient's cancer cell SKOV3 cell, the virus plasmid by the medium transmission to cancer cells in vitro and PCR amplification, the ultraviolet spectrophotometry to detect virus particles concentration, degree of TCID50 method in detecting infectious droplets, and calculate the virus than activity, to ensure the implant virus contains E1A gene fragment, the control group patients were implanted with recombinant adenovirus rAd - soluble tumor E1A - CDglyTK, to observe inhibiting tumor response. Results To get DNA fragments by PCR amplification in vitro, it was implanted recombinant adenovirus containing soluble tumor E1A gene fragment for gel electrophoresis. The degree of infectious droplets get virus activity of the treatment group virus particles concentration ratio by ultraviolet spectrophotometry measured(3.56%) was higher than the control group(2.01%). The treatment group was injected the virus components in rAd - E1A - CDglyTK in vitro tumor suppression experiments, the SKOV3 cells growth inhibition rate (16.59±1.57) was significantly higher than the control group containing rAd-CDglyTK growth inhibition rate (10.80±1.47). The treatment group growth inhibition rate (26.12±8.11) was high than the control group (1.69±4.12) in vivo tumor suppression experiments, the difference had statistically significant (P＜0.05). Conclusion Recombinant adenovirus rAd - soluble tumor E1A-CDglyTK has good inhibitory effect of killing tumor, killing tumor in the body is stronger than killing tumor in vitro, the curative effect is distinct, it should use to be promoted.

Recombinant adenovirus soluble tumor; RAd-E1A-CDglyTK; In the body; In vitro

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.9.008

吉林 132011 北华大学附属医院肿瘤科 （高云东 王翠霞）北华大学附属医院神经内科 （李晶玉） 北华大学附属医院科研办公室 （刘进） 北华大学附属医院药剂科 （尹桂华） 北华大学附属医院免疫研究室（宋玉国）