单次、分次照射与125 I粒子低剂量率照射对人喉鳞癌Hep2细胞的抑制作用

黄鹂 刘敬佳 杜立法 曲昂 赵勇 王俊杰# 张建国 张杰

1北京大学第三医院肿瘤治疗中心北京大学近距离治疗中心，北京100191

2中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室，北京100101 3北京大学口腔医院口腔颌面外科，北京100081

单次、分次照射与125I粒子低剂量率照射对人喉鳞癌Hep2细胞的抑制作用

黄鹂1刘敬佳1杜立法1曲昂1赵勇2王俊杰1#张建国3张杰3

1北京大学第三医院肿瘤治疗中心北京大学近距离治疗中心，北京100191

2中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室，北京1001013北京大学口腔医院口腔颌面外科，北京100081

目的探讨125I粒子持续低剂量率照射与分次照射、单次照射对人喉鳞癌细胞Hep2的抑制作用及其作用机制。方法实验分为无照射对照组（Ctrl组）、单次照射组（SDR组）、分次照射组（FDR组）和125I粒子持续低剂量率照射组（125I-CLDR组）四组。采用细胞克隆形成实验法检测Hep2细胞在不同照射条件下细胞克隆的形成能力；用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期阻滞情况；用蛋白印迹法检测不同照射条件后Hep2细胞总γ-H2AX、CyclinB1、Caspase3蛋白表达的变化。结果经2 Gy、4 Gy、6 Gy的剂量照射，125I-CLDR组Hep2细胞克隆形成率均低于SDR组和FDR组。经4 Gy的剂量照射后，125I-CLDR组Hep2细胞出现G2/M期阻滞，且阻滞效应较SDR组及FDR组的细胞强；125I-CLDR组Hep2细胞的凋亡比例明显高于SDR组及FDR组；三个照射组γ-H2AX、CyclinB1、Caspase3、NF-κB、P21和Cdk1的表达水平上调，125I-CLDR组p-Cdc25c蛋白表达水平低于SDR组和FDR组。结论在本实验条件下，125I粒子持续低剂量率照射较单次照射、分次照射能够诱发更多Hep2细胞出现DNA损伤、引起持续的G2/M期阻滞、诱导细胞凋亡并抑制细胞的再增殖。

125I粒子；低剂量率照射；Hep2细胞；DNA损伤；细胞周期

Oncol Prog，2015，13(1)

放射治疗是治疗喉鳞癌的标准手段之一[1]。放射治疗包括体外照射和体内照射，其中体外照射按照射距离又可分为远距离照射和近距离照射。近距离照射主要包括组织间照射、腔内或管内照射、模照射及术中放置导管的照射，而放射性粒子组织间近距离放疗技术是将放射性同位素直接植入肿瘤内，属于组织间照射。在临床上，近距离照射治疗既可以单独用于治疗喉鳞癌，也可与远距离照射治疗相互补充；特别是对局部复发的肿瘤，放射性粒子组织间近距离放疗更具优势[2-6]。放射性粒子组织间近距离放疗可在肿瘤局部获得更高的照射剂量，而对周围正常组织的损伤更小，具有更微创和患者更易接受的优势。本实验拟从细胞和分子水平揭示125I粒子持续低剂量率照射与单次高剂量率照射、分次高剂量率照射对喉鳞癌Hep2细胞的抑制作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人喉鳞癌细胞Hep2采用含10%胎牛血清的RPM I1640培养基于37℃、5%的CO2培养箱中培养。

对数生长期的细胞，经胰酶-EDTA消化制成单细胞悬液，被种植于35mm的培养皿中，细胞贴壁24 h后进行照射。

1.2 实验分组

实验分为4组：无照射对照组（control group，Ctrl组）、单次高剂量率照射组（high dose rate single dose radiation group，SDR组）、分次高剂量率照射 组（high dose rate fractionated dose radiation group，FDR组）、125I粒子持续低剂量率照射组（iodine-125 seeds continuous low dose rate radiation group，125I-CLDR组），每组设置3个平行样。

1.3 照射方式

125I-CLDR组采用粒子照射模型[7-8]。模型分上下两层，均由聚丙乙烯材料制成。下层为粒子板，有6个照射单元。每个照射单元的直径均为34mm，在其圆周上等距离排列了14个粒子槽，其内放置初始活度为92.5MBq（2.5mCi）的125I粒子源（购自中国同辐股份有限公司）。上层为培养板，与粒子板照射单元相对应的位置上放置35 mm的培养皿。照射时，培养皿及粒子照射模型被放置于铅盒内进行防护。随后将铅盒放在培养箱（37℃，5% CO2）内，并持续照射培养。粒子照射的初始剂量率为2.77 cGy/h；照射剂量在2Gy、4Gy、6Gy时分别需要73.6 h、150.0 h和229.4 h。高剂量率照射时，使用RS2000 X-ray生物辐射仪（购自美国Rad Source Technologies公司），其剂量率为6312 cGy/h。单次照射组为一次照射完成总剂量；分次照射组每24 h接受照射一次，每次的照射剂量为2Gy。

1.4 检测方法

1.4.1 细胞克隆形成实验 取一定数量的Hep2活细胞种植于35mm培养皿中，24 h后对其进行照射，完成2 Gy、4 Gy、6 Gy剂量的照射后，继续培养。设开始种植细胞的日期为第1天，至第14天时，将各组细胞用甲醇固定10m in，瑞氏-吉姆萨染色液染色5m in，随后在常规显微镜下计数克隆数。以大于50个细胞为1个克隆，并计算克隆形成率（plating efficiency，PE）及临床常用照射剂量2 Gy的存活分数（survival fraction at 2 grey，SF2）。此外，PE的计算公式为：（克隆数/细胞接种数）×100%；SF2的计算公式为：（照射组PE/对照组PE）×100%。

1.4.2 细胞凋亡的检测 照射4 Gy后的第24 h、48 h和72 h，分别消化4组细胞并均制成浓度为每毫升5×105个的单细胞悬液。取1m l的细胞悬液，用PBS（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）清洗2遍后，再用200μl染液（其中Annexin V-FITC 5μl，Binding Buffer 195μl；购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司）避光室温孵育15m in。用1m l PBS洗1遍，并经400μl PBS重悬，加入10μl碘化丙啶（PI，1μg/m l；购自美国Sigma公司）后用流式细胞仪（型号为FACScan，购自美国Becton Dickinson公司）进行细胞凋亡的检测。检测时，Annexin V-FITC阳性细胞为凋亡细胞。

1.4.3 细胞周期的检测 4 Gy剂量照射后的第24 h、48 h和72 h，分别消化4组细胞并均制成浓度为每毫升5×105个的单细胞悬液。取1m l的细胞悬液，用预冷的PBS清洗2遍，预冷的2m l 75%酒精予以固定，然后置于4℃冰箱过夜。PBS洗2遍洗去残余酒精，300μl PBS重悬细胞，加入PI和RNaseA至终浓度50 ug/m l，37℃水浴避光孵育30 min。随后用流式细胞仪（型号为FACSCalibur，购自美国Becton Dickinson公司）进行细胞周期的检测，结果用ModFitLT 2.0软件进行分析。

1.4.4 相关蛋白表达量的检测 4 Gy剂量照射后，4组细胞均于第24 h、48 h和72 h三个时间点被分别提取总蛋白。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白样品，电泳后用PVDF膜进行转膜。5% TBST脱脂牛奶封闭2 h后，加入一抗于4℃下孵育过夜，TBST液洗涤3遍，再加入二抗于室温下孵育1 h，TBST液洗涤3遍，最后进行显影。用蛋白印迹法检测γ-H2AX、CyclinB1、Caspase3、p-Cdc25c、Cdk1、P21和NF-κB的表达情况。

1.5 统计学处理

每个实验重复2～3次，数据以均数±标准差来表示。以Graphpad prism 5.0软件进行统计学处理，采用t检验或双因素方差分析比较组间差异。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同照射剂量对四组Hep2细胞克隆形成的抑制作用

细胞克隆形成实验结果表明：在2 Gy、4 Gy、6 Gy的照射剂量下，不同的照射方式对Hep2细胞克隆形成的抑制能力不同，其中125I-CLDR组的Hep2细胞克隆形成受到的抑制最强；Ctrl组不接受2 Gy的剂量照射，125I-CLDR组的SF2为0.27，SDR组的SF2为0.34，FDR组为分次照射，每天仅接受一次2 Gy的照射，故其SF2与SDR组的SF2是一致。只有6 Gy的剂量照射后，125I-CLDR组的PE值对比SDR组的和FDR组的才具有统计学意义（均P＜0.05，表1）。

表1 四组细胞在不同照射剂量下的PE（%）

2.2 4Gy照射剂量下四组Hep2细胞凋亡情况

以4 Gy剂量照射后，与Ctrl组相比，其他三组第24 h、48 h、72 h的细胞凋亡率均增高；其中125ICLDR组相同照射条件下的细胞凋亡率显著高于SDR组和FDR组，组间差异均具有统计学意义（均P＜0.05，表2）。

表2 各组在4Gy的照射剂量下不同时间节点测得的细胞凋亡率（%）

2.3 4Gy照射剂量对Hep2细胞周期的影响

与Ctrl组相比，4 Gy剂量照射后，其他三组在第24 h、48 h和72 h的G1期细胞比例均下降，G2/M期细胞比例均增加；其中125I-CLDR组在各时间节点下以G1期细胞比例下降得最明显，G2/M期细胞比例增加得最明显（图1）。

2.4 4Gy照射剂量对相关蛋白表达的影响

在4 Gy的照射剂量下，与Ctrl组相比，以β-Actin为内参，其他三组细胞24 h、48 h、72 h三个时间节点检测到的γ-H2AX、Caspase3和CyclinB1蛋白的表达水平均明显增加；其中125I-CLDR组γ-H2AX的表达水平高于FDR组，其CyclinB1的表达水平也呈现出同样的趋势（图2）。与Ctrl组相比，以β-Actin为内参，其他三组细胞的NF-κB、P21的表达水平上调，FDR组和125I-CLDR组这两种蛋白的表达水平均高于SDR组的；125I-CLDR组Cdk1表达水平上调最明显，但其p-Cdc25c的表达水平低于FDR组和SDR组（图3）。

3 讨论

大部分喉鳞癌患者在临床诊断时就处于Ⅲ期或Ⅳ期，治愈率低于30%。晚期喉鳞癌患者需要手术、放疗和化疗等综合治疗，尽管这些治疗手段有很大的改进和提高，但是在过去30年中，喉鳞癌患者的长期生存率并没有实质性的进展，其5年生存率仅为30%～40%[9]。

125I放射性粒子治疗喉鳞癌受到中国学者的广泛证实和验证，大量报道均明确此方法具有微创、局部剂量高和损伤小的优势[2-6，10]。单次粒子照射可引起细胞的DNA损伤，出现细胞周期的阻滞，从而启动细胞修复机制。如果DNA的损伤能被完全修复，则可以继续细胞周期进程；如果不能被修复，则可能诱导细胞的凋亡。有研究显示，辐射可引起DNA双链断裂，组蛋白H2AX磷酸化可形成γ-H2AX，其常聚集于DNA双链断裂的位点或其附近[11]。本研究中，以4 Gy的剂量照射后，Hep2细胞的γ-H2AX表达水平明显上调，与文献报道一致。但是关于喉鳞癌在持续低剂量率照射条件下的放射生物学效应鲜有报道。本研究中，γ-H2AX蛋白的表达水平在三个照射组中均较对照组明显升高。克隆形成实验结果表明，在2 Gy、4 Gy、6 Gy剂量的照射下，125I-CLDR组Hep2细胞克隆形成能力的抑制作用最强。克隆形成的实验为临床疗效的证明提供了基础，同时也支持了γ-H2AX表达的实验结果。

Ma等[12]和Yang等[13]在对125I粒子治疗肿瘤所进行的研究中发现，辐射后细胞的凋亡率明显增加。在本研究中，125I-CLDR组Hep2细胞完成4 Gy照射后24 h、48 h、72 h的凋亡率较SDR组、FDR组均有明显增加，且组间差异具有统计学意义。与Ctrl组相比，其他三组细胞中的Caspase3蛋白的表达水平均明显增加。Caspase家族在凋亡的调节中具有重要作用，且Caspase3是最重要的凋亡执行因子之一[14]。本研究中，125I-CLDR组的Caspases3蛋白表达水平持续升高，说明在125I-CLDR照射下，Hep2细胞凋亡有持续增加的趋势。

当DNA受损时，细胞周期的进程会被中断，修复蛋白NF-κB等的表达量会上调以便能够修复细胞的损伤。这个过程由细胞周期检测点Cyclin/ Cdk复合物来调控。DNA损伤后，通过p53的稳定表达，上调p21的转录，p21结合并抑制CyclinE/ Cdk2及CyclinD/Cdk4/6。p21是抑制进入G1/S期的重要因子。细胞要进入有丝分裂期需要CyclinB1/Cdk1复合物的活化[15-16]。CyclinB1在G1期表达水平很低，随着细胞的进程，CyclinB1表达逐渐升高，在G2期表达水平最高，并与Cdk1结合，形成无活性的CyclinB1/Cdk1复合体。在G2/M期，磷酸化的Cdc25c介导CyclinB1/Cdk1复合体的活化，从而促进细胞进入有丝分裂的进程[16]。本研究中，经过三组不同方式照射后，Hep2细胞均出现了G1期细胞比例下降，G2/M期细胞比例增加，虽然三个照射组之间相应细胞周期细胞比例并没有显著的统计学差异，但是其中以125I-CLDR组的变化最明显。照射后，125I-CLDR组Hep2细胞CyclinB1蛋白表达上调最明显，而p-Cdc25c表达水平最低，说明细胞被持续阻滞于G2期，很可能是由于125I粒子持续低剂量率照射抑制了CyclinB1/ Cdk1复合体的活化。由于细胞处于G2/M期时对照射更敏感，因此，125I粒子持续低剂量率照射可能更容易引起Hep2细胞的损伤。

本研究中，125I粒子持续低剂量率照射可导致Hep2细胞凋亡率明显增加，出现持续的G2/M期阻滞，克隆形成能力明显下降，说明125I粒子持续低剂量率照射能够显著抑制Hep2细胞增殖。虽然125I粒子持续低剂量率照射治疗喉鳞癌在临床上是否可行还需被验证，但125I粒子持续低剂量率照射对Hep2细胞的抑制作用对进一步研究有重要的参考价值。

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The inhibition effectsof different irradiationmethodson human laryngealsquamous carcinoma cell line Hep2

HUANG Li1LIU Jing-jia1DU Li-fa1QU Ang1ZHAO Yong2WANG Jun-jie1#Zhang Jian-guo3Zhang Jie3

1Cancer center,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China
2State Key Laboratory of Biomembraneand Membrane Biotechnology,Instituteof Zoology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China3DepartmentofOraland Maxillofacial Surgery,Peking University Schooland Hospitalof Stomatology,Beijing 100081,China

ObjectiveTo investigate the inhibition effects of different irradiation methods on the proliferation of Hep2,which is the human laryngeal squamous carcinoma cell line,and the corresponding mechanisms.MethodFour groups of patients receiving different irradiations were compared in our experiment,which were non-radiation control group(Ctrl),high dose rate single dose radiation group(SDR),high dose rate fractionated dose radiation group(FDR),and iodine-125 seeds continuous low dose rate radiation group(125I-CLDR),respectively.Colony formation assay was used to determine the radiosensitivity of Hep2 cells to each radiation,and flow cytometry was appliedfor detecting cell apoptosis and cell cycle arrest,while the protein expression levels ofγ-H2AX,CyclinB1 and Caspase3 were detected w ith Western blot.ResultThe capability of clone formation of Hep2 cells after 2 Gy,4 Gy,6 Gy irradiation was lower in125I-CLDR group compare w ith SDR and FDR group.After 4 Gy irradiation,125I-CLDR induced the most significant Hep2 cells arrest effect of G2/M among the three groups.And the highest cell apoptosis proportion was seen in125I-CLDR group either.The expression levels ofγ-H2AX,CyclinB1,Caspase3,NF-κB,P21 and Cdk1 increased among three treatment groups.While p-Cdc25c expressed the least in125I-CLDR group.ConclusionIn the context of this study,125I-CLDR obviously reduces cellular DNA repair capacity,induces cell apoptosis and G2/M arrest,and inhibits cell reproliferation.

125I radioactive seeds;low dose rate radiation;Hep2 cells;DNA damage;cell cycle

R739.65

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.01.14

#通信作者（corresponding author），e-mail：junjiewang_edu@sina.cn

2014-06-27）