FITC－NYZL1分子探针标记膀胱癌患者尿脱落细胞特异性的研究

罗 芳，张 帆，罗俊茜，姚 红，庞建智，苏西西，杨晓峰

（山西医科大学：1．微生物与免疫学教研室；2．第一医院泌尿外科，山西太原 030001）

膀胱癌（bladder carcinoma，BC）是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在泌尿系统疾病中均居首位［1］。虽然其恶性程度低，但复发率较高［2］。因此及早发现和确诊、监测复发、改善预后是提高膀胱癌患者生活质量、降低病死率的主要研究方向。目前膀胱癌的诊断主要以膀胱镜、尿脱落细胞学和荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）为主，然而三者都存在一定缺陷［3－4］。随着免疫学及分子生物学技术的发展，肿瘤导向肽（tumor targeting peptide，THPs）作为靶向识别肿瘤的荧光标记显像载体和特异性靶向抗癌药物结合受体，在癌症早期诊断和治疗方面的研究取得了巨大进展［5］。本课题组前期采用体内噬菌体展示文库技术筛选得到膀胱癌BIU－87细胞系的肿瘤导向肽段 NYZL1［6］，本实验则是验证该多肽与人尿液中癌细胞结合的特异性，探讨肿瘤导向肽段NYZL1作为膀胱癌检测靶向标记物的临床使用价值。

1 材料与方法

1．1 受检者资料及分组实验组：2014年8月至2015年1月山西医科大学第一医院66例经膀胱镜检查诊断为膀胱癌的患者，其中男性40例，女性26例，年龄19～88岁，平均年龄67．27岁。对照组：选取年龄相仿的膀胱炎患者12例和健康人24名，其中男性26例，女性10例。

1．2 主要试剂及仪器采用体内噬菌体展示文库技术筛选得到膀胱癌BIU－87细胞系的肿瘤导向肽段NYZL1，是由丝氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、精氨酸和组氨酸6种氨基酸组成，两端以半胱氨酸通过二硫键连接成为结构稳定的小分子多肽［6］。由中肽生化有限公司（杭州）合成导向肽段NYZL1并标记异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），制备荧光分子FITC－NYZL1，通过HPLC及 MS纯化、鉴定该合成肽段纯度≥98%［7］；无菌尿液收集器、4%多聚甲醛液、4′，6－二脒基－2－苯基吲哚（DAPI）染色液、瑞士－吉姆萨复合染液、磷酸盐缓冲液（PBS）等为太原市正合生物化学试剂公司产品；SC－04低速恒温离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；扫描激光共聚焦显微镜（LSCM，日本Olympus公司）；35 mm激光共聚焦培养皿（无锡NEST公司）。

1．3 实验方法

1．3．1 FITC－NYZL1分子探针标记实验 ①尿液离心、沉淀、固定：2h内的新鲜尿液200mL，静置沉淀0．5h，弃去部分上清液。剩余100mL尿液倒入离心管中，1 300r／min离心10min，弃上清液。加4%多聚甲醛液1mL吹打混匀，室温下固定细胞30 min。②样本滴片、孵育、洗涤：混匀液体，再次离心（1 000r／min，5min），弃上清液。吹打混匀沉淀，取20μL混悬液均匀涂于35mm激光共聚焦培养皿中，静置10min。加2mLPBS小心洗涤细胞2～3次，每次3～5min。加入浓度为5μmol／L FITCNYZL1的溶液1mL，4℃孵育1h。弃去培养皿中溶液，加2mLPBS溶液洗涤细胞2～3次，每次3～5 min。③细胞核染色、计数：暗室中滴加DAPI复染剂200μL于细胞区域，室温孵育6～8min。弃去培养皿中溶液，加2mL PBS溶液洗涤细胞2～3次，每次3～5min。加200μL PBS溶液于细胞区域，放置于LSCM下镜检。计数：200倍显微镜下随机取上、下、左、右、中5个视野观察100个细胞并计数绿色荧光细胞，计算阳性（肽结合）细胞的百分比（绿色荧光细胞总数／100个细胞）。

1．3．2 尿脱落细胞学检查 ①尿液收集、离心、滴片：将2h内的新鲜尿液200mL静置约0．5h，弃去部分上清。剩余100mL尿液离心（1 300r／min，10 min），弃上清，滴片，自然干燥后放入95%乙醇中10 min。②样本染色：滴加0．5～0．8mL瑞－姬染色液于涂片上，并让染液覆盖1min。将等体积或2倍体积的PBS缓慢滴加到瑞－吉染色液上面，用洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，两液体充分混合，染色5～10min。用自来水缓慢从载玻片一端冲洗，晾干。③样本封片、镜检：待载玻片自然干燥，滴加中性树胶、加盖盖玻片封片，普通光学显微镜观察并记录结果，由病理科医师鉴定，镜下发现有恶性肿瘤细胞判定为检查阳性，其余均判定为检查阴性。

1．4 统计学方法采用SPSS 17．0软件对数据进行统计学分析，数据以±s表示，采用单因素方差分析和卡方检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 FITC－NYZL标记结果LSCM下显示66例膀胱癌患者尿液中都检测出与荧光探针结合的细胞，阳性率为100%（66／66），不同临床病理分期患者荧光探针与尿脱落细胞的结合率为Ta10%～48%（平均30%），T133%～78%（平均57%），T258%～87%（平均73%），T3～471%～93%（平均85%）。而对照组中尿脱落细胞与荧光探针特异性结合率很低，炎性患者0%～10%（平均6．5%），健康人0%～5%（平均3%）（图1、图2）。使用单因素方差分析比较，实验组与对照组间差异有统计学意义（P＜0．001）。FITC－NYZL1对尿液中膀胱癌细胞特异性标记的结合率随肿瘤分期的升高而升高（表1）

图1 FITC－NYZL1靶向标记尿脱落细胸

表1 膀胱癌不同分期FITC－NYZL1结合率的比较

图2 FITC－NYZL1荧光分子探针靶向标记图

2．2 尿脱落细胞学检查结果膀胱癌患者常规尿脱落细胞学阳性率为18．18%，其中各个临床分期的阳性率 分 别 为 Ta0% （0／9），T19．1% （2／22），T223．8%（5／21），T3～435．7（5／14）%（图3）。使用卡方检验对FITC－NYZL1标记和尿脱落细胞学进行检测，两组间差异有统计学意义（P＜0．05）。即FITCNYZL1荧光探针可显著提高膀胱癌患者尿脱落细胞中癌细胞的特异性结合率。

图3 尿脱落细胞学检查图（Wright－Giemsa，×400）

3 讨 论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，早期发现和确诊是治疗膀胱癌的首要任务。膀胱镜检查作为诊断膀胱癌的“金标准”，其具有侵入性，可引起尿道损伤及泌尿系感染，且膀胱镜只能观察膀胱内部结构的表层，对早期病变及深层结构不能有效识别，对微小和扁平状癌的识别和定位比较困难，容易导致漏诊而不能早期诊断和治疗。尿脱落细胞学检查特异性较高（＞90%），但灵敏度低（＜50%），在低分级膀胱癌中更显著［8］。2001年由美国食品药品管理局批准的运用FISH探针来识别膀胱癌的畸变染色体，其灵敏度明显高于尿脱落细胞学检查，但国内FISH技术仍处在临床研究阶段，灵敏度和特异性与国外也有多不同［9］。

近年来，随着光学分子成像及其探针技术的发展，THPs在肿瘤疾病的早期筛查、诊断和治疗上都有深入研究。THPs与肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞特异性结合，而不与正常细胞结合，与单克隆抗体相比，其细胞穿透力强、稳定性好［10］。KOIVISTOINEN等［11］通过体外噬菌体展示技术获得的非小细胞肺癌导向肽段ARRPKLD能特异性聚集于荷瘤小鼠的肿瘤组织。LEE等［12］通过T7噬菌体展示文库技术筛选出人膀胱癌HT－1367细胞系特异性导向肽CSNRDARRC，并证实该多肽对膀胱癌患者的尿液细胞和病理组织能发生特异性结合。JIA等［13］研究认为，FITC－CSNRDARRC导向肽段能与尿液中的膀胱癌细胞特异性结合，通过FITC－CSNRDARRC靶向标记、FISH技术和尿脱落细胞学技术进行膀胱癌的诊断，结果显示探针靶向标记的灵敏度与FISH相比无明显差异，与尿脱落细胞学检查相比均存在显著差异，在无创性检查中靶向标记技术更接近病理组织学诊断，有望用于肿瘤及其转移灶的早期诊断与治疗。这些关于THPs的研究无疑使肿瘤疾病实现早期诊断成为了可能，因而THPs日益受到人们的重视，也有望成为肿瘤临床应用研究的新方向。

本课题组前期采用体内噬菌体展示文库技术筛选得到中国人膀胱癌BIU－87细胞系的肿瘤导向肽段NYZL1。通过体内外检测技术，在细胞、组织和整体动物水平系统地证明膀胱肿瘤导向肽段NYZL1能够与膀胱癌BIU－87细胞及其移植瘤靶向性结合，并可携带荧光素FITC标记肿瘤组织，是膀胱癌分子靶向诊断的重要载体。本研究我们将多肽应用到临床膀胱肿瘤诊断和监测中，以膀胱肿瘤患者尿脱落细胞为研究对象，分别应用FITC－NYZL1分子探针标记技术和尿脱落细胞学检测技术进行疾病的诊断，进一步验证该小分子探针对膀胱癌患者尿脱落细胞的特异性。研究表明，常规尿脱落细胞学检查的阳性率仅为18．18%，对早期肿瘤敏感性更差，FITC－CSSPIGRHC标记膀胱癌患者的尿脱落细胞，即使在Ta期肿瘤仍然能够检测到肿瘤细胞，与常规尿脱落细胞学检测对比研究表明靶向肽探针的检测可提高尿脱落细胞学检查的灵敏度，提高早期、低级别膀胱尿路上皮癌的筛查率。FITC－NYZL1靶向检测的结合率也随着肿瘤分期的升高而升高，相比FISH技术，此技术更加便捷。此外，我们在少许膀胱炎患者和正常人中也检测出微弱的荧光，这可能以尿液暴露于体外导致细胞成分发生改变有关，因此在进行此项检查时一定要收集新鲜尿液，且4℃冰箱保存，必须在短时间内完成检测。

总之，虽然FITC－NYZL1分子探针还处于实验研究阶段，但其具有灵敏度高、特异性强、无创性、实验操作流程简单等优势，很有可能会在膀胱尿路上皮癌的早期筛查中发挥更大的作用，成为筛查膀胱尿路上皮癌的一种理想的、新的无创性检查方法。

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