非同源末端连接修复相关因子对DNA损伤修复调控及肿瘤治疗作用的研究进展

李蔚蔚，孔金昕，漆永梅，黄德军

（兰州大学生命科学学院，甘肃兰州730000）

非同源末端连接修复相关因子对DNA损伤修复调控及肿瘤治疗作用的研究进展

李蔚蔚，孔金昕，漆永梅，黄德军

（兰州大学生命科学学院，甘肃兰州730000）

细胞在内源性或外源性因子的胁迫作用下会产生各种损伤，包括遗传物质DNA的双链断裂（DSB）。非同源末端连接（NHEJ）是哺乳动物细胞中DSB损伤修复的一种主要机制。NHEJ过程中一些主要因子如DNA依赖性蛋白激酶、DNA交联修复蛋白1C、X射线修复交叉互补蛋白4/DNA连接酶Ⅳ和X射线修复交叉互补蛋白4类似因子对DNA损伤修复（DDR）具有重要的调控作用，其中任何一种因子的改变都会影响DDR的效率。此外，NHEJ相关因子与肿瘤发生息息相关。本文针对NHEJ相关因子调控DSB修复方面的研究作一简要综述，并对NHEJ修复相关因子在肿瘤治疗中的研究进行总结。

DNA依赖性蛋白激酶；DNA双链断裂；DNA断端接合修复；DNA损伤修复

DNA是生物细胞储存遗传信息的重要物质，它的完整性和稳定性对于细胞的存活具有重要意义。很多因素包括外源性的离子辐射、紫外线、化学物质和内源性的DNA复制及重组过程中的失误，都能对DNA造成损伤［1-2］。其中，DNA双链断裂（DNA double-strand breaks,DSB）是最严重的一种损伤类型，能直接导致细胞的癌变或凋亡［1］。针对这些损伤，细胞也进化出一系列完整而精确的修复机制，以防止癌症的发生或细胞死亡［2-3］。

哺乳动物细胞应对DSB损伤修复的机制主要包括两方面：同源重组（homologous recombination，HR）和非同源末端连接（nonhomologous end-joining，NHEJ）［3］。NHEJ在细胞的各个周期都能被激活（HR主要在DNA复制的S期/G2期被激活）并维持基因组的稳定性，因而它被认为是哺乳动物细胞中DSB修复的主要机制［4］。NHEJ修复机制主要包括DNA依赖性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）、DNA交联修复蛋白1C（DNA cross-link repair IC，artemis）、X射线修复交叉互补蛋白4（X-ray repair cross-complementing 4，XRCC4）、DNA连接酶Ⅳ（DNA ligaseⅣ，LigⅣ）和XRCC4类似因子（XRCC4-like factor，XLF）等因子构成的通路［5-6］。修复的基本过程包括三个步骤：首先，DNA-PK调节亚基Ku识别并结合到DNA断裂末端，将DNA-PK催化亚基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNAPKcs)招募过来形成具有全酶活性的DNA-PK；然后，artemis被募集并与DNA-PKcs形成复合体，DNA-PK通过自身磷酸化及磷酸化artemis，使得artemis/DNA-PKcs复合体具有了核酸外切酶活性，与其他相关因子协调对DNA断裂末端进行修饰和加工；最后，XRCC4/LigⅣ及XLF复合体对DNA末端进行处理和连接，完成整个修复通路［5-7］。

在NHEJ修复通路中，DNA-PK是关键的调控因子，尽管国内已有学者对DNA-PK在DSB修复中的主要作用进行了介绍。但近10年来，对DNA-PK及其他NHEJ相关因子的研究又有很多新的认识和发现，本文特作一综述。

1 NHEJ相关因子对DNA损伤修复的调控

1.1 DNA-PK调控NHEJ介导的DNA损伤修复

DNA-PK是磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K）家族的一员，由1个催化亚基DNA-PKcs、2个调节亚基Ku70和Ku80（也称Ku86）组成，在接触断裂DNA后可以聚合成三聚体，发挥激酶活性对DSB进行修复［5］。

1.1.1 Ku70/80调控NHEJ介导的DNA损伤修复

以往的研究表明，在NHEJ修复过程中，Ku70/ 80作为DNA-PK的调节亚基，其功能主要是作为DSB的识别因子。最新研究表明，Ku70羧基端包含的一个SAP部位（Ku70-SAP）能与DNA双链相连，而Ku80氨基端的环形结构也可与DNA绑定进而被募集到DNA损伤位点［8-9］。Ku80羧基端的曲臂部（Ku-CTD）与DNA-PKcs连接，可将后者募集过来，最终形成完整的DNA-PK三聚体并激活全酶的激酶活性［8,10］。而Ku功能缺陷时，Ku70与DNA的连接、Ku80与DNA-PKcs的连接都会受到抑制（图1）［11-13］。在功能方面，Ku不仅识别DSB，还可识别和调控NHEJ相关因子，促进NHEJ的修复效率。例如，①Ku70/80促进XLF与DNA的连接［14］。Ku70募集XLF到损伤位点，形成更稳定的Ku70/80-XLF-DNA复合物，有利于DSB的损伤修复；而Ku70/80的不完整可能会干扰XLF的稳定性，影响修复进程［15］。②Ku70/80可与LigⅣ的BRCT部位连接，促进LigⅣ的酶活性并增强末端连接的效率［16］。③Ku70还具有5′-dRP/AP裂解酶的作用，能切除断裂端损伤的核苷酸，Ku70缺失会导致AP位点的减少，并使得NHEJ的连接效率降低［17］。④PAXX（XRCC4与XLF的间接同源物，又称C9orf142）也可与Ku结合促进NHEJ介导的修复［18］。

1.1.2 DNA-PKcs调控NHEJ介导的DNA损伤修复

早期研究显示，DNA-PKcs作为DNA-PK的催化亚基，主要通过磷酸化及自磷酸化调控着NHEJ通路中的多种因子。一方面，DNA-PKcs与DNA结合后改变自身构象，经磷酸化修饰后，激活DNA-PK全酶活性［19］。但是，早期针对DNA-PKcs构象方面的研究并不深入。随着先进技术的应用和方法的成熟，近些年针对DNA-PKcs结构及磷酸化方面的研究也有了新的拓展。这些区域无定向特性并远离激酶功能域，属于DNA的结合域。

图1 非同源末端连接NHEJ相关因子对DNA损伤修复过程的调控。当起始因子Ku70/80（黄色椭圆）缺失或被抑制（a），影响后期因子的募集，会导致NHEJ无法完成而激活同源重组通路；DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）（蓝色椭圆）的缺失或抑制（b），严重影响NHEJ修复进程，导致NHEJ修复通路被抑制而激活同源重组通路；X射线交叉互补蛋白4（XRCC4）/DNA连接酶Ⅳ（LigⅣ）作为损伤修复最后连接的核心因子，两者的缺失直接会造成NHEJ被抑制（c）；artemis、XRCC类似因子（XLF）的缺失不会完全抑制NHEJ（d），但是会降低它的修复效率。然而当各个因子募集正常时（A、B、C、D），NHEJ完成损伤修复。

具有享廷顿蛋白延长因子3（Huntinotin,elong ation factor3 cEF3）、蛋白质磷酸酶2A和酵母激酶TOR1（HAET）重复结构，该构象包含蛋白激酶的活性域，以及磷酸化其他蛋白及DNA-PKcs自磷酸化的部位；而较小的HAET重复结构域则属于DNA的绑定部位［8,10］。当DNA或Ku缺失时，DNA-PKcs通过氨基端构象改变激活其激酶活性，这显然不同于早期研究［20］。

DNA-PKcs磷酸化的研究发现，DNA-PKcs磷酸化的位点可以因不同外源因子诱导而各不相同：离子辐射主要引起T2609及S2056的磷酸化［21］；外来化合物如硒（Se）主要诱导S2056与T2647位点的磷酸化［22］。T2609及S2056位点的磷酸化可调控修复通路的选择：当T2609的磷酸化受阻时，NHEJ受到抑制，促使DNA损伤修复偏向HR通路，在此通路选择中，DNA-PK酶活性的降低对NHEJ的抑制起关键作用（图2）［23］。DNA-PKcs可磷酸化artemis并使后者获得核酸内切酶活性，它还可磷酸化末端连接因子Ku、XLF及XRCC4等，增强DSB损伤修复的连接效率［23-24］。

近年来，针对DNA-PKcs自磷酸化位点方面的研究，除了比较公认的ABCDE（ABCDE cluster T2609、S2612、T2620、S2624、T2638和T2647）和PQR位点（PQR cluster S2023,S2029、S2041、S2051、S2053、S2056）之外，还有N（N terminal cluster S56，S76）、JK（JK cluster T946，S1004），LZ（leucine zipper cluster S1470，S1546）和S3205等位点［21,23］。研究结果显示，这些自磷酸化位点与DNA损伤后通路的选择紧密相关［23］。例如，N位点自身磷酸化抑制HR通路，并以依赖激酶活性的方式选择NHEJ通路；而JK位点的自磷酸化能显著抑制NHEJ但促进HR参与的DNA损伤修复，且此时激酶活性不参与通路的选择；S3205位点的自磷酸化只与HR通路相关，不参与NHEJ通路的调控（图2）［19,22-23］。DNA-PKcs自磷酸化可调控其他NHEJ因子，如促进artemis内切酶活性等［23］。

此外，DNA-PKcs通过调控毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（ataxia telangiectasia mutated,ATM）及济失调性毛细血管扩张和Rad3相关蛋白（ataxia-telangiectasia and Rad3-related,ATR）的磷酸化参与HR通路的调节，而且DNA-PK激酶活性的降低导致大量异常的DNA-PKcs的自磷酸化，影响H2AX的磷酸化（gH2AX的形成），甚至降低HR的修复效率［9］。

图2 DNA-PKcs磷酸化及自磷酸化调控修复通路的选择。DNA-PKcs的磷酸化（红色实线方框）及自磷酸化（红色虚线方框）是非同源末端连接与同源重组通路选择的开关：ABCDE cluster自磷酸化可以促进非同源末端连接；PQR cluster的自磷酸化限制非同源末端连接的进展，促进同源重组；JK自磷酸化抑制非同源末端连接促进同源重组修复通路；T2609及S2056的磷酸化受到抑制时，非同源末端连接修复通路被抑制而启动同源重组。

1.2 artemis调节NHEJ介导的DNA损伤修复

artemis于2001年被报道［25］，尽管与其他NHEJ因子相比发现较晚，但近10年来，针对artemis的研究，无论在结构还是功能方面，都比较深入。从结构上来说，artemis是金属β-内酰胺酶蛋白家族的一员，该家族成员均有一个保守的由金属β-内酰胺酶折叠和β-CASP结构域组成的SNM1结构域，其中金属β-内酰胺酶具有核酸外切酶的活性，而β-CASP结构域的凹槽可与DNA结合以便更好的进行损伤修复［25-26］。紧邻β-CASP区域，在artemis的羧基端还有一个特殊的Art-Cter部位，artemis通过该结构可与DNA-PKcs连接，形成的复合物被DNA-PKcs磷酸化后具有核酸内切酶活性（因为artemis的羧基端区域对其核酸内切酶酶活性具有抑制作用，而当羧基端被磷酸化后发生构象改变后，可以解除这种抑制作用），对DNA发夹结构和5′或3′突出端进行切割，这有助于后期高效的DNA损伤修复［10,26-29］。此外，artemis也可通过Art-Cter部位与LigⅣ连接，调控DNA损伤修复通路（NHEJ或HR）的选择［10］。就功能而言，artemis主要是调控NHEJ的修复效率。artemis与LigⅣ及XRCC4形成不依赖于DNA或DNA-PKcs的复合物，进一步加强XRCC4/LigⅣ的活性，促进高效的NHEJ修复［4，28］。当artemis缺失时，尽管XRCC4/LigⅣ依旧可以发挥作用，但NHEJ修复被减弱，而机体为了维护自身稳态，会激活高效的HR通路以完成DNA损伤修复［4，26］。值得注意的是，artemis除了在NHEJ中发挥作用外，还参与其他因子介导的修复，如artemis作为ATM的底物因子，可以被ATM磷酸化，放大信号作用，在G2/M期与ATM共调节ATM介导的DNA损伤修复［28］。

1.3 XRCC4/LigIV和XLF相互作用调节NHEJ介导的DNA损伤修复

XRCC4与LigⅣ是NHEJ修复过程中连接断裂DNA的重要因子。早期研究显示，XRCC4与LigⅣ形成XRCC4/LigⅣ复合体后，在DNA-PKcs的协同作用下，连接DNA的两断裂端，完成NHEJ中双链的连接过程［4，30］。近期的研究进一步从蛋白质结构方面解释了它们的作用，并拓展了相关的功能。LigⅣ有2个BRCT部位（氨基端BRCT1/羧基端BRCT2），其中BRCT1与Ku具有较高的亲和力，有利于LigⅣ被Ku募集［10］；而BRCT2部位可与XRCC4的卷曲螺旋部位紧密连接。因此，LigⅣ与XRCC4之间的相互依赖性较强，当XRCC4（或LigⅣ）被敲低，表达量减少时，LigⅣ（或XRCC4）也会受到抑制，使整个NHEJ修复通路受到影响（图1）［31］。LigⅣ可作用于XRCC4与XLF，LigⅣ缺失或减少会影响后者对断裂DNA链的识别，从而延缓修复效率［10,32］。除了BRCT1和BRCT2两个连接部位，LigⅣ还具有一个腺苷酰化催化位点，其腺苷酰化作用可以被XLF加强，从而促进末端连接的效率，有利于高效的DNA损伤修复［32-33］。LigⅣ作为连接因子还可调控NHEJ与HR通路的选择：当LigⅣ功能正常时，其通过DNA绑定部位与DNA连接，有助于NHEJ的启动和末端连接的进行［8,16］；当LigⅣ完全缺失时，因末端连接无法完成，NHEJ受到抑制而启动HR通路。与LigⅣ相似，XRCC4也具有调节通路选择的作用，XRCC4缺陷的细胞经辐射后，因NHEJ无法正常进行而启动HR修复［31］。

XLF作为XRCC4类似因子，也是NHEJ修复通路中发现较晚的因子之一，于2006年在病变患者中发现并被命名为XLF［33］。在NHEJ修复中，XLF的羧基端是它与DNA连接的主要部位［10］。XLF作为支架蛋白可以与XRCC4形成紧密的螺旋复合物，通过增强XRCC4/LigⅣ的活性，提升末端连接的效率［34］。XLF与XRCC4/LigⅣ相互作用可调控DDR的进程：XLF表达下调可引起显著的辐射敏感性，使细胞活力下降（这与XRCC4下调时造成的影响相似），同时也会导致DDR过程中的连接效率降低，所以XLF的正常表达是高效DDR所必需的［32-33］。

由此可见，在整个NHEJ修复过程中，XLF，XRCC4和LigⅣ保持正常功能，对DNA损伤修复过程是必不可少的，如果后阶段的末端连接过程受到影响，也会显著降低修复效率。

2 NHEJ相关因子与肿瘤

综上所述，在NHEJ介导的DSB损伤修复通路中，各个因子之间的协调作用对细胞存活是必不可少的。若损伤修复无法完成，将导致细胞走向死亡或癌变。癌细胞由于脱离了正常细胞的周期制约，导致失控性的增殖与生长。同时，在增殖过程中，细胞内DNA损伤程度明显增加，为应对这些损伤，许多修复因子的表达发生改变，如Ku及DNA-PK蛋白在人宫颈癌细胞中均有异常现象［35-37］。

目前，针对肿瘤的治疗主要是通过药物损伤肿瘤细胞的DNA，诱导细胞凋亡，达到清除癌变细胞的目的［38］。例如，顺铂和5-氟尿嘧啶等药物主要通过破坏DNA的正常结构和功能，促进细胞凋亡，从而杀死肿瘤细胞［39］。然而，这些药物在损伤肿瘤细胞的同时也会影响正常细胞，因此，靶向药物治疗成为现阶段肿瘤治疗的热点。DNA-PK作为肿瘤治疗中一个潜在靶点，具有非常重要的意义，因为与正常细胞相比，DNA-PK在肿瘤细胞中通常会超表达，而对DNA-PK的抑制，可增强肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，促进细胞衰老或死亡，增强疗效［40-41］。此外，抑制DNA-PK激酶的活性，也可增加癌细胞对辐射的敏感性，加速其衰老或凋亡［42-43］。总之，特异性地抑制DNA-PK的表达或其酶活性，均可促进细胞衰老或死亡，使机体内的肿瘤细胞得到有效的清除，为提升肿瘤或癌症临床治疗的效果提供了理论支持。

除了DNA-PK，NHEJ中的其他相关因子与肿瘤的关系也受到广泛关注。Ku70的异常表达与卵巢浆液性肿瘤恶变相关。在胃癌中，Ku70/80的过表达增加了细胞对博雷霉素的抗性，而抑制Ku70/80则可增加肿瘤细胞的放射敏感性。因此，在放疗过程中，通过抑制Ku70/80表达的药物，可提高肿瘤放疗的效果［44-45］。XRCC4突变的增加与膀胱尿路上皮肿瘤、肝细胞癌等多种癌症的发生紧密相关［46-47］。artemis，LigⅣ和XLF在肿瘤细胞中的缺失或低表达也会影响细胞对辐射的敏感性，如HeLa细胞中artemis（D37N-413aa）片段的突变增加了细胞的致敏性（因为突变的artemis片段与DNA-PK结合形成更为稳定的复合物，破坏了DNA-PKcs对内源性artemis的磷酸化进程，影响后者的内切酶活性，从而抑制NHEJ修复，导致细胞凋亡）［48］。所以，在肿瘤或癌症的治疗过程中，可通过对DNA-PKcs，artemis，LigⅣ和XLF的抑制减缓DSB修复，促进细胞凋亡［49-50］。

总之，NHEJ相关因子可以作为肿瘤治疗中的潜在靶点。然而，对于不同类型的肿瘤细胞，NHEJ相关因子的表达情况及作用机制依然有待深入研究，这些因子在肿瘤治疗中的作用也需进一步验证。

3 结语

目前针对NHEJ修复通路的报道很多，但研究结果各不相同，特别是在人体肿瘤治疗过程中，DNA-PK与artemis，XRCC4，LigⅣ和XLF等相关因子之间的关系及应用效果尚无定论，仍需更多的体外或体内实验研究予以阐明。相信不久的将来，DNA-PK及相关的因子可作为肿瘤细胞的药物靶点，广泛应用于肿瘤和癌症的临床治疗之中。

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Regulation of nonhomologous end-joining-related factors in DNA damage repair and tumor treatment

LI Wei-wei,KONG Jin-xin,QI Yong-mei,HUANG De-jun
（School of Life Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

DNA double-strand break（DSB）is one of the various lesions induced by endogenous or exogenous stresses in cells.The nonhomologous end-joining（NHEJ）is a main mechanism in response to DSB in mammalian cells.The major factors（DNA-dependent protein kinase，artemis，X-ray repair cross-complementing 4/DNA ligaseⅣand XRCC4-like factor）in the progress of NHEJ play very important roles in mediating DNA damage repair（DDR），and the change of any factor will affect the DDR efficiency.In addition，NHEJ-related factors are associated with tumorigenesis.In this paper，we reviewed the actions of NHEJ-related factors in DSB repair and summarized the research progress in these factors in cancer therapy.

DNA-dependent protein kinase；DNA double-strand breaks；DNA end-joining repair；DNA damage repair

The project supported by National Natural Science Foundation of China（20907019）；and Fundamental Research Funds for the Central Universities（lzujbky-2013-m03）.

HUANG De-jun，E-mail：huangdj＠lzu.edu.cn，Tel：（0931）8912893

R394.6

A

1000-3002-（2015）04-0607-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.012

2014-10-11接受日期：2015-02-28）

（本文编辑：乔虹）

国家自然科学基金项目（20907019）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（lzujbky-2013-m03）。

李蔚蔚，女，硕士研究生，主要从事遗传毒理学研究；E-mail：bingningbj＠126.com；黄德军，男，博士，副教授，主要从事环境动物学和遗传毒理学研究。

黄德军，E-mail：huangdj＠lzu.edu.cn,Tel：（0931）8912893