哮喘小鼠肺组织Nuocytes增多与GITR-GITRL表达的关系

张梦莹，徐芸芸，吴静，张盼，张淡宜，彭静静，齐晨，纪晓昀，夏圣，苏兆亮，王胜军，许化溪

（江苏大学医学院免疫学与免疫检验系，江苏镇江212013）

哮喘小鼠肺组织Nuocytes增多与GITR-GITRL表达的关系

张梦莹，徐芸芸，吴静，张盼，张淡宜，彭静静，齐晨，纪晓昀，夏圣，苏兆亮，王胜军，许化溪

（江苏大学医学院免疫学与免疫检验系，江苏镇江212013）

目的：检测哮喘小鼠肺组织中Nuocytes相关指标和GITR-GITRL的表达，探讨哮喘时Th2极化微环境的改变。方法：选择8只Balb/c小鼠，随机分为2组，模型组于第1天，第11天用OVA致敏，第22至26天用2%OVA溶液雾化激发，对照组用PBS处理；采用流式细胞术检测小鼠肺组织内GITR表达和Nuocytes细胞数量；qRT-PCR法检测Foxp3、RORα、ICOS、ST2、IL-5、IL-13和GITR及其配体GITRL的mRNA表达水平；对GITR-GITRL和Nuocytes及其相关分子的表达水平进行相关性分析。结果与对照组相比，模型组小鼠肺组织中Nuocytes细胞数和GITR表达均升高，且GITRL、Foxp3、RORα、ICOS、ST2以及IL-5和IL-13 mRNA表达水平均明显上调；GITR与RORα和ST2、IL-5、IL-13的表达水平均呈正相关。结论：哮喘小鼠肺组织中Nuocytes和GITR-GITRL表达增高，提示哮喘时GITR-GITRL上调的T细胞免疫应答可能与Th2主导的免疫失衡和Nuocytes极化相关。

Nuocytes；GITR；GITRL；哮喘；小鼠

哮喘是一种慢性过敏性气道炎症，病理特征主要表现为急性可逆性支气管气流受限、支气管-肺组织高反应性、气道嗜酸粒细胞浸润、黏液分泌增多等。目前，普遍认为机体哮喘时的免疫状态向Th2型偏倚［1］，表现为2型细胞因子和转录因子IL-4、GATA3等表达水平升高。

近来发现一新型固有淋巴细胞Nuocytes［2-3］或称Ⅱ型固有免疫细胞（Group 2 innate lymphoid cells，ILC2s），在哮喘疾病中起重要作用。Nuocytes经IL-25、IL-33刺激活化，产生和分泌大量细胞因子，如IL-5和IL-13等。Nuocytes不表达T/B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等特异性标志，可诱导共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）为阳性［4-5］，维甲酸相关孤核受体α（retinoid acid receptor related orphan receptorα，RORα）是其分化和发挥生物学作用必需的转录因子。Nuocytes主要免疫作用是参与Th2应答过程，其极化可能是构成Th2细胞优势分化的重要因素。

糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced TNF receptor family related protein，GITR）是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员之一［6-8］，为Ⅰ型跨膜蛋白，1997年由Nocentini等在杂交瘤细胞株上克隆出，其配体即GITRL。表达有GITR的Treg细胞能有效地发挥免疫抑制作用，控制和维持机体的免疫平衡。而当GITR与其配体GITRL共表达时，GITR-GITRL的相互作用则可消除Treg细胞的免疫抑制功能，并作为免疫应答的正向协同刺激信号，参与免疫性疾病的炎症损伤过程。本研究拟通过检测哮喘小鼠肺组织GITRGITRL和Nuocytes的分布以及相关细胞因子的表达水平，分析GITR-GITRL对Nuocytes及其相关分子表达水平的影响，从区域免疫学的角度了解哮喘时Th2极化微环境的变化。

1 材料与方法

1.1 小鼠哮喘模型的建立

SPF（Specific pathogen-free）级雌性Balb/c小鼠（6～8周龄）8只，购自扬州大学比较医学中心，动物合格证号：No.201403201。随机分为对照组和模型组，每组4只。模型组建模方法参照文献［9］并加以改进，即于第1天和第11天腹腔注射致敏液0.1 mL［50μg鸡卵清蛋白（OVA）+10%氢氧化铝凝胶2 mg］，第22天至第26天以无菌PBS配制的2%OVA溶液超声雾化吸入60 min，最后一次雾化吸入24 h后处死小鼠。对照组用PBS处理。

1.2 试剂

OVA（Sigma公司），Trizol试剂（Invitrogen公司）；反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司）；GITR和Lin单克隆抗体（eBioscience公司），ST2、ICOS单克隆抗体（Biolegend公司）。

1.3 流式细胞术检测小鼠肺组织GITR的表达和Nuocytes细胞数

取小鼠肺组织，剪碎并用胶原酶消化，筛网过滤和ACK裂解液裂解红细胞，细胞计数后用抗GITRAPC或抗Lineage-FITC、抗ICOS-PerCP/Cy5.5和T1/ST2-PE作荧光抗体染色，然后用C6流式细胞仪分析。

1.4 RNA提取、引物设计及qRT-PCR

剪取约1/4肺组织块冲洗，剪碎后加1 mL Trizol提取总RNA，反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行qRT-PCR（反转录和定量试剂均为TaKaRa公司产品）。实验过程中每份标本均设3个复孔并作3次重复检测。引物均用Oligo 6软件设计（表1），由上海生工生物技术公司合成。

表1 引物序列及产物长度

1.5 统计学分析

统计学分析采用GraphPad软件。组间数据比较用独立样本t检验，相关性分析用Pearson相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 哮喘小鼠模型诱导结果

建模后哮喘小鼠表现为烦躁不安，弓背且腹部鼓动明显，点头样喘息，呼吸加深加快等；HE染色镜下可见哮喘小鼠肺泡间及伴行血管周围有大量炎症细胞浸润、黏膜皱壁减少、杯状细胞肥大增生，见图1。与对照组相比，OVA模型组血清总IgE水平明显升高（t=2.427，P＜0.05）。见图2。

图1 模型组小鼠肺组织的病理改变（HE染色×10）

图2 小鼠血清总IgE水平比较

2.2 肺组织Nuocytes数量和GITR表达水平的改变

流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织内GITR阳性细胞增加，且伴有Nuocytes细胞数增多；免疫荧光抗体染色结果也显示GITR表达增强；qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织GITR mRNA表达水平明显升高。见图3。

图3 小鼠肺组织内GITR表达和Nuocytes细胞数量

2.3 哮喘小鼠肺组织GITRL和Nuocytes相关分子的表达

qRT-PCR检测结果显示，模型组小鼠肺组织中GITRLmRNA水平明显高于对照组；此外，Foxp3以及Nuocytes细胞相关分子ICOS、ST2、RORα、IL-5和IL-13 mRNA表达水平均明显高于对照组（P均＜0.05）。见图4。

2.4 哮喘小鼠肺组织GITR与Nuocytes相关分子表达水平的相关性分析

相关性分析结果表明，GITR表达与RORα，ST2，IL5和IL-13的表达呈明显正相关（P均＜0.05）。见图5。

图4 GITR-GITRL和Nuocytes相关分子的mRNA表达

图5 GITR与nuocytes相关分子表达水平的相关性分析

3 讨论

支气管哮喘是以气道过敏性炎症为主要病理特征的免疫性疾病，近年来欧共体呼吸健康调查（ESRHS）和国际儿童哮喘与变态反应研究机构（ISAAC）的流行病学调查研究均显示，哮喘患病率明显升高。迄今为止，哮喘的病理机制尚不完全清楚。研究表明，哮喘患者体内Th1/Th2细胞处于失衡状态，Th2细胞呈优势分化［10］。Nuocytes可分泌大量的IL-5和IL-13，支撑和维持着Th2细胞的极化状态，促进哮喘的发展。

GITR组成性地高表达于Treg细胞表面，而静息的初始CD4+T细胞表面表达量相对较低，当抗原刺激活化T细胞后，Treg和CD4+T细胞表面的GITR表达量均会增高［11-13］。在缺乏足够GITRL时，高表达GITR的Treg细胞具有负向免疫调控作用，而GITR与其配体GITRL结合则构成T细胞活化的协同刺激信号，GITR-GITRL的相互作用影响Treg细胞的增殖及其免疫抑制功能［8-9］。

本研究显示，哮喘小鼠肺组织内GITR表达和Nuocytes数量升高；GITR及其配体GITRLmRNA表达水平相伴上调，同时nuocytes相关分子ICOS、ST2、IL-5、IL-13及转录因子RORα的mRNA水平也明显升高；GITR-GITRL表达量与Nuocytes细胞相关的细胞因子或转录因子水平呈正相关。由此推测，GITR和GITRL相伴高表达，一方面可阻碍Treg细胞的负向调控作用，另一方面可能对Th2细胞极化发挥促进作用。有研究表明，Th2细胞的特异性转录因子GATA3是炎症条件下稳定Foxp3（Treg转录因子）表达及功能的正调控因子［14-15］，而Treg细胞中Foxp3也可通过上调去泛素化酶USP21的转录和表达，从而维持GATA3蛋白的稳定性［16］。本研究结果显示，哮喘小鼠肺组织Foxp3 mRNA呈高表达，由此可见其促进Th2细胞的极化。GITR-GITRL高表达与Nuocytes相关细胞因子或转录因子的上调呈正相关，可能是直接地相互影响，也可能是间接作用的结果，但最终都导致Th2细胞极化之微环境，构成哮喘的免疫失衡状态，其具体机制仍待进一步研究。

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Relationship between increased nuocytes and GITR-GITRL expression levels in lung tissue of asthmatic m ice

ZHANGMeng-ying，XU Yun-yun，WU Jing，ZHANG Pan，ZHANG Dan-yi，PENG Jing-jing，QIChen，JIXiao-yun，XIA Sheng，SU Zhao-liang，WANG Sheng-jun，XU Hua-xi
（Department of Immunology，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To detect the changes of numbers of nuocytes and levels of GITR-GITRL in the lung of asthmaticmice，analyze the relationship between them，then to explore the changes of Th2-polarized micro-environment at the locus of allergic inflammation when with asthma.M ethods：Eightmice were devided into 2 groups randomly，asthmamodelswere sensitized with OVA on 1st，11st day，then nebulized inhalation with OVA on day 22-26，control group with PBS.Flow cytometry was used to detect numbers of nuocytes and cellswhich express GITR；qRT-PCR was also used to test themRNA levels of GITR-GITRL，molecules and cytokines associated with nuocytes；pearson correlation analysiswas used to detect the correlation between GITR-GITRL and nuocytes.Results：Compared with the control group，model group showed high levels of nuocytes and GITR-GITRL，meanwhile，with increased mRNA levels of GITRL，Foxp3，RORα，ICOS，ST2，IL-5 and IL-13；and there was a positive correlation between GITR expression and RORα，ST2，IL-5，IL-13 expression.Conclusion：Nuocytes and the expression of GITR-GITRL increased synchronously in lung of asthmaticmice，which suggested that the up-regulation of T cell-mediated immune response by GITR-GITRLmay be associated with Th2-biased response and polarization of nuocytes.

nuocytes；GITR；GITRL；asthma；mice

张梦莹（1990—），女，硕士研究生；苏兆亮（通讯作者），副教授，博士生导师，E-mail：szl30@yeah.net；许化溪（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：xuhx@ujs.edu.cn

R562.25

A

1671-7783（2015）04-0277-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150099

国家自然科学基金资助项目（31270947）

2015-05-06 ［编辑］ 刘星星