一株植物乳杆菌产苯乳酸特性的研究

邓　林，刘延岭（四川工商职业技术学院，四川都江堰611830）

一株植物乳杆菌产苯乳酸特性的研究

邓林，刘延岭
（四川工商职业技术学院，四川都江堰611830）

摘要：研究了一株植物乳杆菌DL-13产苯乳酸特性，通过反相液相色谱对发酵产物进行了鉴定。结果表明：DL-13能还原苯丙酮酸生成苯乳酸，最佳发酵条件为：温度36℃，初始培养pH 7.0，苯丙酮酸浓度10 g/L，摇瓶转速为100 r/min。在此条件下24 h时获得最大苯乳酸含量为3.86 g/L，转化率达到38.6%。DL-13对其他底物如苯丙氨酸、苯丙酮酸钠、苯丙酮酸铵、苯丙酮酸钙等都具有一定的发酵能力。

关键词：植物乳杆菌；苯乳酸；苯丙酮酸；特性

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸菌的一种，常存在于发酵的蔬菜和果汁中[1]。作为人体胃肠道的益生菌群，具有调节肠道内菌群的平衡、提高机体免疫力、促进营养物质吸收和降低胆固醇水平等保健作用[1-3]。除此之外，植物乳杆菌在发酵肉制品、发酵植物性食品等食品工业中应用也十分广泛[4]。

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA），也称3-苯基乳酸或2-羟基-3-苯基丙酸，存在于天然蜂蜜中[5-6]。近年来研究发现，苯乳酸作为天然抑菌物质，可以抑制腐败菌、致病菌，特别是对真菌的感染，有望在未来成为一种新型的防腐剂应用于食品工业及药物制剂[7]。

在前期试验中，研究了植物乳杆菌Lactobacillus plantarum DL-13的分离、鉴定。本试验以其为出发菌株，研究了其产苯乳酸的特性，以期为进一步的菌种驯化选育及工业化发酵生产苯乳酸奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

植物乳杆菌Lactobacillus plantarum DL-13：由我院食品生物技术实验室筛选并保藏。

1.1.2试剂

苯乳酸：美国Sigma公司。其他试剂均为分析纯：成都金山化学试剂有限公司。

1.1.3培养基

斜面培养基（MRS）：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温-80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2～6.6。

种子培养基：液体MRS培养基。

发酵培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖10.0 g，苯丙酮酸10.0 g，吐温-80 5.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁 0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2～6.4。

1.2仪器与设备

DYZ-160P型恒温振荡培养箱：上海德洋意邦仪器有限公司；721型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；Agilent 1100型高效液相色谱仪、Agilent Zorbax SB-C18 USP L1分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：美国Agilent公司。

1.3方法

1.3.1菌体生长量的测定

采用离心干重法[7]。取发酵液100 mL，6 500 r/min离心10 min，用PBS磷酸缓冲液（pH=7.4）洗涤3次，105℃干燥至恒重后称重。

1.3.2还原糖的测定

采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法测定发酵液中的还原糖（以葡萄糖计）[8]。取3 mL DNS试剂加到1 mL离心过的发酵液中，混匀，于热水浴中加热15 min后迅速冷却至室温。加水定容至25 mL，充分混匀后于520 nm处测定吸光度。同时做标准曲线。

1.3.3苯乳酸合成过程的分析

在装液量为25 mL的250 mL锥形瓶中进行实验，发酵24 h后进行分析，分别考察温度、初始培养pH、苯丙酮酸浓度和摇瓶转速对菌株DL-13合成苯乳酸的影响。

每隔2小时取一次样，测定苯丙酮酸在苯乳酸产生过程中的变化情况。采用反相高效相色谱对苯丙酮酸分解前后的组成成分进行分析、鉴定。

反相高效液相色谱法条件为：流动相A为0.5g/L三氟乙酸溶液，B为乙腈溶液，洗脱程序是0～20 min为10%～100%B，20min～23min保持100%B。检测波长为210 nm，柱温30℃；流速1 mL/min，进样量10 μL[9-10]。

2　结果与讨论

2.1菌株DL-13的培养过程

菌株DL-13于36℃、初始培养pH 6.4，摇瓶转速为150 r/min条件下，在发酵培养基上培养的过程参数见图1。

菌株在培养基中生长良好，当培养基中葡萄糖在22 h左右彻底耗尽后，菌体干重达到最大值4.8 g/L。在培养过程中，pH在前2 h有稍微上升，接着逐渐下降，在12 h时降至6.0，最后降至4.3。

2.2发酵产物的鉴定

李兴峰等研究发现[10]：在乳酸菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的过程中，转氨反应是限速步骤，成为苯乳酸产生的瓶颈，可以采用苯丙酮酸代替苯丙氨酸作为底物合成苯乳酸。本试验采用苯丙酮酸作为底物，使用反相高效相色谱对苯丙酮酸分解前后的组成成分进行分析、鉴定。结果表明，苯丙酮酸在菌株DL-13的生长代谢过程中，通过合成苯乳酸的途径进行分解。

图1　菌株DL-13的培养过程Fig.1　Time course of strain DL-13

图2　菌株DL-13发酵上清液的HPLC图谱Fig.2　Chromatograms of strain DL-13 culture medium supernatant

2.3菌株DL-13的苯乳酸合成特性

2.3.1温度对菌株DL-13合成苯乳酸的影响

培养温度对菌株DL-13合成苯乳酸的影响见图3。

由于乳酸菌为中温菌，目前乳酸菌利用苯丙酮酸发酵合成苯乳酸的反应都选择在30℃～37℃左右进行[11]。可以看出，菌株DL-13合成苯乳酸的最佳温度为36℃左右，此时转化率为38.0%，高于或低于此温度，转化率都有所降低，这与其他报道相符[11-12]。并且在高于37℃后，转化率急速下降。说明苯丙酮酸的分解和苯乳酸的生成与温度具有相关性。低于36℃时，随着温度的升高，相关酶的活性增强，有利于苯乳酸的生成；而过高的温度又会导致酶的变性失活，使合成效率大大降低。因此确定最佳发酵温度为36℃。

2.3.2初始培养pH对菌株DL-13合成苯乳酸的影响初始培养pH对菌株DL-13合成苯乳酸的影响见图4。

图3　温度对菌株DL-13合成苯乳酸的影响Fig.3　Effect of temperature on Phenyllactic acid production

图4　初始培养pH对菌株DL-13合成苯乳酸的影响Fig.4　Effect of initial pH on Phenyllactic acid production

由于乳酸菌的最适生长pH范围为5.5～6.0，所以选取了pH 4.5～8.5进行培养。可以看出，菌株DL-13合成苯乳酸的最佳pH为7，此时转化率为38.5%，高于或低于此pH，转化率都有所降低，这与其他报道一致[12]。并且在4.5～7的pH范围内，转化率缓慢增加，说明菌株DL-13耐酸性较强。因此确定最佳初始培养pH为7.0。

2.3.3底物苯丙酮酸浓度对菌株DL-13合成苯乳酸的影响

在菌株DL-13合成苯乳酸的过程中，底物苯丙酮酸一方面可以通过转氨反应生成苯丙氨酸，一方面又可以通过还原反应生成苯乳酸[13]。为了实现最大的苯乳酸得率，确定底物苯丙酮酸的最适添加浓度，在添加了不同苯丙酮酸浓度的MRS液体培养基中对菌株DL-13进行培养，24 h后检测发酵液中苯乳酸的含量和转化率，结果如图5所示。

至10 g/L时，苯乳酸含量随之增加至3.80 g/L，最大得率为38.0%。但随后，虽然苯乳酸含量变化不明显，由于底物苯丙酮酸浓度的增加，导致转化率迅速降低。这可能由于参与相关反应的酶已经饱和，增加苯丙酮酸的浓度已无意义，因此确定苯丙酮酸在发酵培养基中的添加量为10 g/L。

2.3.4摇瓶转速对菌株DL-13合成苯乳酸的影响

乳酸菌是一种兼性厌氧菌，在有氧或无氧环境中均能生长繁殖。可在有氧（O2）或缺氧条件下，可通过不同的氧化方式获得能量，兼有需氧呼吸和无氧发酵两种功能。故在研究兼性厌氧菌发酵时，可根据所需选择通氧量以获得相应结果[14]。摇瓶转速对菌株DL-13合成苯乳酸的影响见图6。

图5　苯丙酮酸浓度对菌株DL-13合成苯乳酸的影响Fig.5　Effect of phenylpyruvic acid concentration on Phenyllactic acid production

图6　摇瓶转速对菌株DL-13合成苯乳酸的影响Fig.6　Effect of rotation speed on Phenyllactic acid production

可以看出，静止培养也能获得较大的生物量和苯乳酸含量，但是随着摇瓶转速的增加，50 r/min时，能获得最大的生物量4.5 g/L，100 r/min时，能获得最大的苯乳酸产量3.78 g/L。这可能是由于兼性厌氧菌在有氧的环境下进行有氧呼吸大量繁殖，在无氧的环境下进行无氧呼吸一般不繁殖而进行发酵。综合分析，选择100 r/min摇瓶转速进行培养。

2.3.5DL-13转化苯丙酮酸生成苯乳酸的过程

菌株DL-13于36℃，初始培养pH7.0，苯丙酮酸浓度10 g/L，摇瓶转速为100 r/min条件下，转化苯丙酮酸生成苯乳酸的过程见图7。

从图7可知，培养4 h左右即有苯乳酸产生，8 h后快速增加，至24 h时达到最大，含量为3.86 g/L，此后逐渐下降。为了获得最大得率，应在24 h时停止培养并分离发酵产物。苯丙酮酸转化为苯乳酸的得率为38.6%。此外，苯乳酸产生的过程中还有少量的苯丙氨酸生成，且在24 h左右达到最大值。可以看出，苯丙氨酸与苯乳酸的合成大致一致。

2.4菌株DL-13对其他底物的利用实验

有文献表明[15]，乳杆菌可以以苯丙氨酸、苯丙酮酸、苯丙酮酸钠、苯丙酮酸铵、苯丙酮酸钙等作为底物，发酵代谢合成苯乳酸。在36℃、初始培养pH 6.4，摇瓶转速为150 r/min条件下的条件下，选取了数种具有代表性的底物进行考察，研究菌株对这些化合物的利用情况。结果见表1。

图7　菌株DL-13转化苯丙酮酸生成苯乳酸的过程Fig.7　Phenyllactic acid production from phenylpyruvic acid by strain DL-13

表1　菌株DL-13对其他底物的利用Table 1　Utilization of other substrats by strain DL-13

可以看出，除了苯丙酮酸钙外，其他形式的底物转化率都达到了25%以上，且以苯丙酮酸铵的转化率最高，为32.0%。这可能是由于钙盐的溶解性较差所致。

3　结论

通过对菌株DL-13的苯乳酸合成特性进行研究，发现苯丙酮酸在菌株DL-13的生长代谢过程中，通过合成苯乳酸的途径进行分解。在发酵过程中，温度、pH、底物苯丙酮酸的浓度及摇瓶转速对苯丙酮酸转化和苯乳酸的合成都具有较大影响。

菌株DL-13实验室摇瓶条件下利用苯丙酮酸合成苯乳酸的最佳条件是温度36℃，初始培养pH 7.0，苯丙酮酸浓度10 g/L，摇瓶转速为100 r/min，在此条件下24 h时获得最大苯乳酸含量，为3.86 g/L，苯丙酮酸转化为苯乳酸的得率为38.6%。

研究还发现菌株DL-13对其他底物如苯丙氨酸、苯丙酮酸钠、苯丙酮酸铵、苯丙酮酸钙等都具有一定的发酵代谢能力，表明其在发酵生产苯乳酸方面具有很好的应用价值。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.043

收稿日期：2015-05-04

基金项目：四川省教育厅课题（13ZB0364）

作者简介：邓林（1977—），女（汉），副教授，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

Study on Phenyllactic Acid Production Characteristics of Lactobacillus Plantarum

DENG Lin，LIU Yan-ling
（Sichuan Technology and Business College，Dujiangyan 611830，Sichuan，China）

Abstract：Phenyllactic acid production characteristics of Lactobacillus plantarum DL-13 was studied.The production of fermentation was identified by HPLC.The results showed that phenylpyruvic acid was reduced by strainDL-13intophenyllacticacid3.86g/Lphenyllactic acid content was received after culturing DL-13 24 hours under the optimal fermentation condition：temperature 36℃，initial pH 7.0，phenylpyruvic acid content 10 g/L and shaking speed 100 r/min.The conversion rate was 38.6%.DL-13 could also ferment other substrates such as phenylalanine，sodium phenylpyruvate，phenylpyruvic acid ammoniumand calcium phenylpyruvate.

Key words：Lactobacillus plantarum；phenyllactic acid；phenylpyruvic acid；characteristic