SPE-HPLC检测动物源性食品中3种氟喹诺酮类药物残留

池永红，云雅光（包头轻工职业技术学院，内蒙古包头014035）

SPE-HPLC检测动物源性食品中3种氟喹诺酮类药物残留

池永红，云雅光
（包头轻工职业技术学院，内蒙古包头014035）

摘要：以3种氟喹诺酮类抗菌药物-诺氟沙星、环丙沙星，恩诺沙星为研究对象，结合固相萃取串联高效液相色谱，建立动物源性食品中3种分析物残留的准确、灵敏的分析方法。研究采用Cleanert S C18固相萃取小柱为基质净化柱，以Hypersil-ODS C18柱（4.6 mm×250 mm）为液相分离柱，0.05 mol/L H3PO4-三乙胺溶液（pH 2.4）∶乙腈为82∶18（体积比）为流动相，流速0.8 mL/min，能够达到基质净化和分析物富集、分离目的。根据实验结果，所建立的方法对3种氟喹诺酮类药物的最低检出限分别达到1.5、1.3、1.5 μg/L；对3个添加浓度下的鸡肉、鸡蛋、牛奶和牛肉等复杂食品样品中3种分析物残留的检测也具有较高的准确度（回收率>90.0%）和重现性（RSD<5.0%，n=3）。

关键词：氟喹诺酮类药物；固相萃取；高效液相色谱；检测

肉类、奶类等动物源性食品营养丰富，是人类获取动物蛋白的主要途径。然而兽用药物在畜牧和渔业生产过程中的不当或非法使用，使动物源性食品成为风险较高、隐患较多的食品之一。近年来，动物源性食品中兽药残留日趋严重，成为影响其质量的重要因素，严重威胁了人类的身体健康，也影响了相关产品出口贸易的进行，极度制约了我国食品经济的发展。

喹诺酮类药物（Quinolones，QNs）是指人工合成的含有4-喹酮母核的一类抗菌药物，临床上主要治疗细菌感染性疾病[1-4]。该类药物通过抑制细菌体内的拓扑异构酶Ⅱ和Ⅳ活性，进而抑制DNA的复制起到杀灭细菌作用[5-6]。而氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones，FQNs）由于在C6位上引入的F，从而大大提高了抗菌作用，对革兰氏阳性菌、阴性菌、衣原体、支原体以及结合杆菌等均有明显作用，逐渐成为QNs的主流[7-8]。

诺氟沙星（Norfloxacin，NOR）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIPRO）、恩诺沙星（Enrofloxacin，ENRO）是3种典型的FQNs药物，也是目前兽医临床上用量最大、范围最广的抗菌药物[9]。一般认为，这3种药物不滞留于动物组织，但大剂量使用容易导致在生物体内产生蓄积毒性和细菌耐药性，并引发一系列不良反应如神经中毒、肾功能损伤、过敏反应等[10-11]。因此，许多国家和组织等都将其列入限制使用的兽药范围，并制订出相应的最高残留限量（MRL）[12]。美国已禁止在食用动物养殖中使用FQNs；欧盟（EC）则规定恩诺沙星与环丙沙星在动物肌肉、肝脏和肾脏中的最大残留量之和分别为100、200和300 μg/kg。在我国，国家质监总局也规定了诺氟沙星、恩诺沙星在动物肌肉、肝脏和肾脏中的MRLs值分别为100、200、300 μg/kg[13]。

高效液相色谱分析方法是目前针对动物源性食品中FQNs残留检测的主要方法之一[14]，具有高准确度、高灵敏度的特征。另一方面，由于动物源性食品基质复杂，本身存在较多脂肪、蛋白质等物质，不利于其中痕量存在的FQNs药物残留的准确测定，通常需要严格的样品前处理过程。所以，针对动物源性食品中FQNs残留，寻找一种集基质净化、痕量有害物富集于一体的准确、灵敏、快速的分析检测方法具有重要的意义。

1　材料与方法

1.1主要仪器与试剂

高效液相色谱仪配荧光检测器（LC20ARF10AXL）：Shimadzu，Japan；匀浆组织破碎机（AM-6，Japan）；台式冷冻离心机（Centrifuge 5804R）：德国Eppendorf公司；振荡器（QL-901）：海门其林贝尔仪器制造有限公司；固相萃取柱（Cleanert S C18 100 mg，3 mL）：Agela Technologies公司；超纯水系统（18.2 MΩ cm）：Water Pro watersystem，Labconco Corp.USA。

诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星标准品：购于浙江国邦药业有限公司；甲醇，乙腈（色谱纯）等有机溶剂：购于天津化学试剂一厂。去离子水自制。

鸡肉、鱼肉、猪肉、鸡蛋、牛奶、牛肉，购于本地超市。1.2液相色谱条件

高效液相色谱仪配荧光检测器，激发波长EX：280 nm，发射波长EM：450 nm；色谱柱：Hypersil-ODS C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L H3PO4-三乙胺溶液∶乙腈（82∶18，体积比），用前超声脱气30 min，恢复到室温，备用；流动相流速：0.8 mL/min，进样量：20 μL，无柱温。

1.3标准溶液的配制

准确称取诺氟沙星、环丙沙星及恩诺沙星标准品各0.010 g，分别溶解于0.05 mol/L H3PO4溶液中，并定容到100 mL，摇匀即得100.0 mg/L标准品储备液，4℃冷藏，储存期1个月。

准确量取3种标准品储备液1.0 mL，用0.05 mol/L H3PO4稀释定容至100 mL，即得1.0 mg/L标准工作液。分别量取5、10、25、50、100、200、250 μL 1.0 mg/L标准工作液于定量瓶中，稀释至1.0 mL，摇匀得到浓度为5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L系列标准溶液。

1.4样品前处理

准确称取粉碎的鸡肉、鱼肉、猪肉样品各2.00 g分别置于25 mL离心管中，分别加入乙腈5.0 mL和0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）5.0 mL，漩涡振荡，4 000 r/min离心5 min，取上清液备用；对所得的组织残渣重复提取一次。合并所得的上清液中加入20.0mL水饱和正己烷，充分摇匀，静置分层，取下层萃取液（组织提取液）备用。

试验选用C18（100 mg，3 mL，300 A）固相萃取小柱作为基质净化柱。固相萃取柱用前依次用5.0 mL去离子水，5.0 mL乙腈进行活化，取10.0 mL组织提取液以均匀流速（约0.5 mL/min）上样，2.0 mL去离子水淋洗，以2.0 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液洗脱，恒定氮气气流吹干，乙腈复溶至1.0 mL，上机分析。

2　结果与分析

2.1色谱条件优化与选择

试验检测的3种氟喹诺酮类药物化学结构中均有羧基和哌嗪环结构，化学性质上存在两性特征。在研究中选用了酸性溶液（0.05 mol/L H3PO4溶液，pH 2.4）与乙腈（82∶18，体积比）为流动相，并添加适量三乙胺作为扫尾剂改善峰形。同时由于盐溶液与有机相混合时容易产生结晶，会使液相色谱仪管路堵塞。实验中以三乙胺调整磷酸溶液pH分别达到1.8～4.5，优化pH对3种氟喹诺酮类药物的分离情况。结果表明，当流动相pH在1.8～3.0范围内时，3种分析物的保留时间基本不变，且峰形对称，分离效果良好。当pH超过3.0时，恩诺沙星的峰形变宽，有明显拖尾现象。结合其他文献和研究，实验中采用低浓度磷酸-三乙胺（0.05 mol/L H3PO4溶液，pH 2.4）与乙腈（82∶18，体积比）混合溶液为流动相，不仅能够获得良好的峰形，也能有效地避免盐类的结晶。

2.2标准曲线的绘制

按照2.3所示方法配制不同浓度（X，μg/L）的3种分析物的标准工作液，并按实验所列色谱条件进行分析测定，以保留时间（诺氟沙星：6.43 min；环丙沙星：8.82 min；恩诺沙星：12.06 min）定性（图1），外标法峰面积（Y）定量，可得3种分析物的标准曲线（图2）。

图1　诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星3种氟喹诺酮类药物的液相色谱图Fig.1Chromatograms of three FQNs-NOR，CIPRO and ENRO

图2　3种氟喹诺酮类药物-诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的标准曲线Fig.2　The standard curves of three FQNs-NOR，CIPRO and ENRO

试验中，3种氟喹诺酮类药物的标准曲线分别为：诺氟沙星：Y=31 719 X+36 7812（R2=0.995 8）；环丙沙星：Y=27 453 X+150 141（R2=0.998 7）；恩诺沙星：Y=448 665 X+407 300（R2=0.999 8）。3种目标分析物都具有良好的分离度，峰面积与浓度之间呈现良好的线性关系。以最低浓度5.0 μg/L的测试数据计算3倍信噪比求得检出限为1.5μg/L（NOR），1.3μg/L（CIPRO），1.5 μg/L（ENRO）。

2.3实际样品检测

研究中以鸡肉、鸡蛋、牛奶、牛肉、鱼肉、猪肉为代表动物源性食品进行添加回收试验，以考察所建立的基质净化方法及3种沙星类抗菌药物检测方法的实际应用能力。准确称取的鸡肉、鸡蛋、牛肉、鱼肉、猪肉样品各2.0 g及牛奶2.0 mL，分别进行诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星浓度为10、20、30 ng/g（或ng/mL）的梯度添加，每个浓度平行3个，样品前处理过程如上所述。基质提取液上机分析取峰面积根据标准曲线计算3种目标分析物的浓度，以加入量与测得量之比计算回收率及变异系数。结果如表1所示。

表1　鸡肉、鸡蛋、牛奶、牛肉、鱼肉、猪肉中三种氟喹诺酮类抗菌药的检测结果Table 1　Results of three FQNs detection in chicken muscle，eggs，milk，beaf，fish and pork samples

续表1　鸡肉、鸡蛋、牛奶、牛肉、鱼肉、猪肉中三种氟喹诺酮类抗菌药的检测结果Continue table 1　Results of three FQNs detection in chicken muscle，eggs，milk，beaf，fish and pork samples

3　结论

本研究建立了固相萃取串联高效液相色谱法测定动物源性食品鸡肉、鸡蛋、牛奶、牛肉、鱼肉、猪肉中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留。通过试验结果比较，确定了色谱条件及样品前处理过程，使其达到良好分离。对于3种分析物的线性范围在50.0 μg/L～500.0 μg/L时的相关系数大于0.99；选定的6种动物源性食品中3种药物残留的加标回收率均大于90.0%；相对标准偏差小于5.0%。该方法具有简便、快捷、精密度和准确性高的特点，能够满足常见动物源性食品中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星检测的技术要求。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.041

收稿日期：2015-07-22

作者简介：池永红（1980—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品发酵和食品检测。

Determination of Three Fluoroquinolones in Animal-derived Food by Combining SPE with HPLC

CHI Yong-hong，YUN Ya-guang
（Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014035，Inner Mongolia，China）

Abstract：An accurate and sensitive method for the detection of three fluoroquinolones-norfloxacin（NOR），ciprofloxacin（CIPRO），enrofloxacin（ENRO）residues in animal-derived food products was developed by combining solid-phase extraction with high performance liquid chromatography.The Cleanert S C18 solidphase extraction column was used for complex matrix purification and one Hypersil-ODS C18 column（4.6 mm× 250 mm）was employed for separation in liquid chromatography.The mobile phase consisted of 0.05 mol/L H3PO4was controlled pH at 2.4 by triethylamine and mixed with ACN at the ratio of 82∶18（volume ratio），and the flow rate controlled at 0.8 mL/min for the purpose of obtaining good substrate clean-up and analytes enrichment.Based on the obtained resluts，the detection limit of three chosen analytes achieved to 1.5 μg/L （NOR），1.3 μg/L（CIPRO），1.5 μg/L（ENRO）in the developed method，good recoveries in chosen chicken muscle，egg，milk and beef samples at three spiked levels of NOR，CIPRO and ENRO were obtained higher than 90.0%with RSD less than 5.0%（n=3），meaning that the developed method in this research was high accuracy and reproducibility.

Key words：fluoroquinolones；SPE；HPLC；detection