肉桂原花青素的片段化研究

姜倩，张加研*，秦永剑，雷福厚

(1.西南林业大学材料工程学院，云南 昆明 650224;2.广西民族大学广西林产化学与工程重点实验室，广西 南宁 530006)

通常所称的肉桂为樟科常绿乔木植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干皮和粗枝皮［1］。在我国肉桂主要分布于广西、广东，全国肉桂的种植面积约27万公顷，产量占世界的38.1%［2］，而广西、广东两省肉桂产量占我国肉桂产量的95%以上［3］。原花青素属黄酮类物质，以儿茶素、表儿茶素及其取代物为结构单元［4］，按聚合度可分为低聚体和多聚体，其中五聚体以上称为多聚体。原花青素主要以多聚体的形式存在，而原花青素低聚体在抗氧化、抗突变等方面有更加显著的效果［5］。因此将多聚体片段化为低聚体，能大大提高原花青素的利用率。原花青素多为黄烷-3-醇结构单元通过C4～C8或/和C4～C6的键合方式构成的“直链型”结构。通过C4～C8或C4～C6连接键的酸催化裂解实现原花青素片段化是原花青素片段化最重要的化学反应之一。在适当的酸性条件下连接键易发生断裂，末端的黄烷-3-醇结构单元(CAT或EPC等)被释放出来的同时，另一结构片断(延伸单元)中C环4位形成的碳正离子易被适当的亲核试剂捕捉，从而形成亲核试剂附加产物［6］。

原花青素多聚体(PPC)片段化的常用方法为硫醇法和间苯三酚法，主要使用苄硫醇和间苯三酚等亲核试剂［7］。但上述方法在反应中使用甲醇等有机溶剂、反应时间过长、亲核试剂使用量过大、需要高压设备，且产物的活性评价仅停留在体外实验阶段以及得到的片段化产物需要进行安全性评价，因此至今仍局限于实验室研究使用阶段，难以进行产业化推广应用。如果将食品来源的茶多酚应用到PPC片段化反应中，并且使反应后低聚体和多聚体分开，以提高低聚体的含量，使原花青素低聚体(OPC)能够进一步在医药品、保健品、食品添加剂、化妆品等领域应用。因此本研究采用广西肉桂为原料提取原花青素，运用茶多酚对PPC进行片段化，以片段化反应后低聚体含量以及低聚体中原花青素含量为指标，通过单因素试验考察片段化反应温度、反应时间、盐酸体积分数和多聚体与茶多酚物料比对反应的影响，并采用正交试验确定片段化反应的最佳条件。

1 实验

1.1 原料、试剂与仪器

广西肉桂粉末(0.078～0.178 mm)，无水乙醇、甲醇、香草醛、盐酸(分析纯，上海国药集团有限公司)，大孔吸附树脂HP-20(北京慧德易科技有限责任公司)，TU-1810DASPC型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、Agilent 1200series高效液相色谱仪、BS-100A自动部分接收器。

1.2 肉桂原花青素多聚体的制备

称取30 g肉桂粉末于1 000 mL三口烧瓶中，再向三口烧瓶中加入500 mL体积分数60%的乙醇，置于预热的50℃恒温水浴锅中，安装好冷凝管、磁力搅拌器，启动搅拌装置提取1.5 h，随后取出烧瓶并冷却至室温，过滤后，滤液利用石油醚萃取，萃取液用旋转蒸发器于45±5℃减压干燥，得到3 000 mg干燥原花青素初提物。

将3 000 mg干燥原花青素初提物溶解在少量体积分数60%的乙醇中，制得的浓溶液匀速加入吸附柱中，依次用体积分数40%、100%的乙醇溶液进行梯度洗脱，将原花青素低聚体、多聚体分开，此部分另有文献报道［8］。

1.3 肉桂原花青素多聚体的片段化反应

1.3.1片段化反应条件 肉桂原花青素片段化反应:称取40 mg茶多酚以及一定质量的肉桂原花青素多聚体，置于15 mL含有0.01 mol/L Vc的一定体积分数的盐酸溶液中，充分溶解，于一定温度的恒温水浴中反应一定时间后置于室温冷却以终止反应。片段化反应液通过HP-20树脂柱(1.5 cm×60 cm)吸附，首先用50 mL蒸馏水洗脱，以去除Vc以及盐酸等小分子物质，然后用体积分数40%的乙醇洗脱反应产物中的低聚体，再用无水乙醇洗脱剩余的多聚体［8］。测定低聚体含量及低聚体中原花青素的含量。

1.3.2低聚体含量测定 低聚体、多聚体溶液用旋转蒸发器于45±5℃减压浓缩，得到低聚体、多聚体样品，并称质量。利用式(1)计算低聚体含量。

式中:y1—低聚体含量，%;m1—低聚体质量，mg;m2—多聚体质量，mg。

1.3.3低聚体中原花青素含量测定 利用香草醛-盐酸法测定原花青素的含量［9］，配制0.2 g/L的低聚体甲醇溶液，取0.5 mL低聚体甲醇溶液加入10 mL比色管中，依次加入3 mL质量浓度为40 g/L的香草醛-甲醇溶液，1.5 mL浓盐酸，加塞摇匀，在20±1℃避光条件下反应15 min后，于500 nm处测其吸光度。利用(+)-儿茶素标准品建立标准曲线，称取10 mg(+)-儿茶素标准品，甲醇溶解定容至25 mL，质量浓度为0.4 g/L，混匀(避光保存)。分别取0、2、4、6、8、10 mL至10 mL比色管中，甲醇定容至10 mL，质量浓度分别为 0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.4 g/L。在上述条件下反应并测定吸光度，以此绘制(+)-儿茶素标准曲线，得拟合回归线性方程:y=353.516 2x－14.230 8，R2=0.999 6，式中:x—(+)-儿茶素质量浓度，g/L;y—吸光度。利用标准曲线计算得到低聚体甲醇溶液中原花青素质量浓度，并利用公式(2)算出低聚体中原花青素含量。

式中:y2—低聚体中原花青素含量，%;c1—低聚体甲醇溶液中原花青素质量浓度，g/L;v1—低聚体甲醇溶液体积，mL;m1—称取低聚体质量，mg。

1.3.4单因素试验 以片段化反应后低聚体含量和低聚体中原花青素含量为评价标准，考察反应温度、反应时间、盐酸体积分数、多聚体与茶多酚物料比对肉桂原花青素片段化反应的影响。

1.3.5正交试验 根据单因素试验结果进行正交试验设计，以片段化反应后低聚体含量和低聚体中原花青素含量为指标，选择片段化反应中适宜的反应温度、反应时间、盐酸体积分数、多聚体与茶多酚物料比，拟定4因素3水平进行L9(34)正交试验设计，并对结果进行分析，求出片段化反应最佳条件。

2 结果与讨论

2.1 片段化反应单因素试验结果

选用茶多酚对原花青素多聚体(PPC)进行片段化研究，以期建立一种环境友好型片段化方法。在以往的研究中多采用某种单体的含量为指标对片段化反应条件进行优化，但是单体含量较低，无法真正反映出片段化反应程度，因此在该方法得到的最优条件下反应，无法得出片段化反应后低聚体含量，因而不利于工业上大量生产原花青素低聚体。本研究利用先前研究结果［8］，利用大孔吸附树脂HP-20分离原花青素，对吸附在树脂上的原花青素进行梯度洗脱，用体积分数40%的乙醇洗脱得到的原花青素聚合度在2～4，可以认为主要是低聚体，用体积分数100%的乙醇洗脱得到的原花青素聚合度在5以上，可以认为主要是多聚体。因此利用大孔吸附树脂HP-20对片段化反应产物进行分离，将反应后产物中的低聚体和多聚体分开，以片段化反应后低聚体含量和低聚体中原花青素含量为指标，探索片段化反应的最佳工艺条件。

2.1.1反应温度的影响 在多聚体与茶多酚物料比1∶1，盐酸体积分数1%，反应时间60 min的条件下，考察反应温度对片断化反应的影响，结果如表1所示。由表1可知，片段化反应后低聚体含量以及低聚体中原花青素含量均随温度的升高先增加后降低，在60℃时达到最大值，之后，随着反应温度的升高而急剧下降，故选择60℃为最佳反应温度。

2.1.2反应时间的影响 选择反应温度60℃，其他条件同2.1.1节，反应时间对片段化反应的影响结果如表1所示。由表1可知，片段化反应后低聚体含量以及低聚体中原花青素含量均随反应时间的增加先升高后降低，在60 min时达到最大值，之后，随着时间的升高而缓慢下降，故选择60 min为最佳反应时间。

表1 单因素试验结果分析Table 1 Results of single factor experiment

2.1.3盐酸体积分数的影响 选择反应温度60℃，其他条件同2.1.1节，盐酸体积分数对片段化反应的影响结果如表1所示。由表1可知，片段化反应后低聚体含量以及低聚体中原花青素含量均随盐酸体积分数的升高先升高后降低，在1%时达到最大值，之后，盐酸体积分数在1% ～3%范围内，急剧下降，在大于3%以后，缓慢下降。故选择1%为最佳盐酸体积分数。

2.1.4多聚体与茶多酚物料比的影响 选择反应温度60℃，其他条件同2.1.1节，多聚体与茶多酚物料比对片段化反应的影响结果如表1所示。由表1可知，多聚体与茶多酚物料比在1∶4～1∶1之间片段化反应后低聚体含量以及低聚体中原花青素含量随多聚体与茶多酚物料比的升高而急剧升高，在1∶1时达到最大值，之后，多聚体与茶多酚物料比在1∶1～4∶1随着物料比的升高而缓慢下降，故选择1∶1为最佳多聚体与茶多酚物料比。

2.2 正交试验结果

根据单因素试验结果，拟定4因素3水平，按L9(34)正交试验设计表进行正交试验，结果分析见表2。

表2 正交试验设计及结果分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

从表2中极差分析可以看出:以片段化反应后低聚体含量为指标各因素对肉桂原花青素片段化反应的影响次序为:C＞D＞A＞B，各因素的最佳水平组合为A3B2C2D3，即反应温度为60℃、反应时间为60 min、盐酸体积分数为1%、多聚体与茶多酚物料比为1∶1。以低聚体中原花青素含量为指标各因素对肉桂原花青素片段化反应的影响次序为:C＞D＞A＞B，各因素的最佳水平组合为A2B3C2D3，即反应温度为50℃、反应时间为90 min、盐酸体积分数为1%、多聚体与茶多酚物料比为1∶1。

2组结果中影响因素的主次顺序相同，说明试验所选因素恰当。综合2个指标，在使原花青素多聚体片段化达到一定程度的同时，又能减少原花青素片段化成本，确定片段化反应的最佳工艺条件:A2B2C2D3，即:反应温度为50℃、反应时间为60 min、盐酸体积分数为1%、多聚体与茶多酚物料比为1∶1。

2.3 片段化反应验证试验

在最佳片段化反应条件下进行3次验证性试验，结果见表3。

由表3可知，片段化反应后低聚体平均含量为65.26%，低聚体中原花青素平均含量为75.28%，说明该工艺条件有一定的可靠性和稳定性。

表3 验证性试验结果Table 3 The results of stability test

3 结论

3.1 采用食物来源的茶多酚为亲核试剂对肉桂中原花青素多聚体(PPC)进行片段化反应，采用大孔吸附树脂HP-20对片段化反应产物进行分级处理，使低聚体从片段化反应产物中分离出来。

3.2 以片段化反应后原花青素低聚体含量以及低聚体中原花青素含量为指标，通过单因素试验和正交试验可以得到，各因素对肉桂原花青素片段化反应的影响次序为:盐酸体积分数＞多聚体与茶多酚物料比＞反应温度＞反应时间。

3.3 最佳工艺条件为反应温度为50℃、反应时间为60 min、盐酸体积分数为1%、多聚体与茶多酚物料比为1∶1，在此条件下进行片段化反应重复验证试验，片段化反应后低聚体含量为65.26%，低聚体中原花青素含量为75.28%。

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