高效液相色谱法测定果汁饮料中苯甲酸含量的不确定度评定

王秋艳 秦朝秋 马嗣同 于 灵 范 杰

（辽宁出入境检验检疫局 辽宁大连 116001）

1 前言

测量不确定度是表征合理地赋予被测量量值的分散性与测量结果相联系的参数，在测量结果的完整表述中，应包括测量不确定度[1]。在GB/T27025-2008《检测和校准实验室能力的通用要求》[2]规定，检测实验室应开展测量不确定度评定工作。随着我国对外贸易交流，对内质量控制要求的提高，测量不确定度日益受到重视，尤其是在食品检测领域[3]。苯甲酸是广泛使用的酸性食品防腐剂，高效液相色谱法已广泛的用于其定量检测[4,5]。笔者根据国家质量技术监督局发布的JJF1059-2012计量技术规范《测量不确定度评定与表示》，并参照其他文献，对高效液相色谱法测定果汁饮料的苯甲酸含量的不确定度进行分析和评定，考察了其不确定的主要来源，为实验过程的控制和检测报告的评估提供了科学依据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要仪器

HP1200液相色谱仪：美国Agilent公司，配有紫外检测器；PL 602-L型和AE100型电子天平：瑞士Mettler toledo公司，感量分别为0.01 g和0.1 mg；单标线容量瓶：100 mL；移液管：1 mL，经辽宁省计量科学研究院检定为A级；2-16K型高速离心机：德国Sigma公司；Mill-Q纯水仪：美国Milipore公司；PHS-2C型酸度计：上海伟业仪器厂。

2.1.2 试剂

苯甲酸标准品：纯度99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer标准品；氨水、碳酸氢钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇、乙醇胺：色谱纯，美国Burdick&Jackson公司。

2.1.3 试验样品

橙汁中苯甲酸、山梨酸和糖精钠成分分析标准物质：GBW（E）100046，辽宁出入境检验检疫局制备。

2.2 方法

2.2.1 标准溶液配制

（1）1 mg/mL苯甲酸储备溶液

准确称取100 mg苯甲酸，加5 mL 20 g/L的碳酸氢钠溶液，加热溶解，移入100 mL容量瓶中，用水定容。

（2）0.1 mg/mL 苯甲酸工作液

取1 mg/mL苯甲酸储备溶液1.0 mL，移入10 mL容量瓶中，用水定容。

2.2.2 样品处理

称取试样 10.0 g（精确至 0.01 g），用氨水（1+1）调pH约7，加水定容至50 mL，离心沉淀，上清液经0.45 μm滤膜过滤，用于高效液相色谱仪测定。

2.2.3 色谱条件

流动相：甲醇：0.02 mol/L乙酸铵溶液=5：95（V/V）；色谱柱：Topsil C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；检测器：UV 230 nm；进样量：10 μL。

3 数学模型和不确定度来源分析

3.1 数学模型

果汁饮料中苯甲酸含量按式（1）计算：

式中：X-样品中苯甲酸的含量，g/kg；

c-进样体积中苯甲酸的含量，mg/L；

m-样品的取样量，g；

V-样品稀释液的总体积，mL。

3.2 不确定来源分析

从测量过程和数学模型分析，果汁饮料中苯甲酸含量不确定度主要来源于标准溶液、仪器的响应值、测量和样品处理操作过程的差异，每一种来源又分别受不同因素的影响。其不确定度来源可归纳为A类和B类不确定度。

（1）A类不确定度是由测量重复性引入的不确定。

（2）B类不确定度主要包括以下几个方面：①标准物质引入的不确定度，主要包括标准物质纯度引入的不确定度、标准溶液配制过程中标准物质称量和量器校准引入的不确定度；②样品称量引入的不确定度；③待测样品溶液定容引入的不确定度；④标准工作液和待测样品进样量引入的不确定；⑤仪器数据处理引入的不确定度。

3.3 不确定的评定

3.3.1 测量重复性引入的不确定度

在重复条件下，对本实验所用橙汁样品重复测定12次，测定结果见表1。

表1 样品重复测定结果

测量重复性的标准不确定为：

测量重复性引入的相对标准不确定度为：

3.3.2 苯甲酸标准物质引入的不确定度

（1）标准品纯度引入的不确定度

苯甲酸购自Dr公司，纯度为99.5%，其最大允许误差为0.5%，按均匀分布计算，其标准不确定为：u（P）=0.5%/=0.29%，相对标准不确定度为：urel（P）=2.9×10-3

（2）标准品称量引入的不确定度

准确称取100.0 mg苯甲酸标准品，所用天平的最大允许误差为0.5 mg，两次称量（减重法）引入的标准不确定度，按均匀分布处理：u（mr）=， 其相对标准不确定度为：urel（mr）=0.408/100=4.1×10-3

（3）标准溶液配制中量器校准引入的不确定度

配制过程中的不确定度主要由量器的校准、量取的变动性、环境因素产生。在实验室20℃的温度下，温度的影响可以忽略；量取的变动性在方法的重复性中已做评定，此处不应重复；故量器的校准为主要的不确定度来源。100 mL（A级）容量瓶、10 mL（A级）容量瓶、1 mL（A级）移液管的最大允许误差分别为：±0.10 mL、±0.020 mL、±0.008 mL， 按均匀分布处理，其标准不确定度及相对标准不确定度分别为：

（4）苯甲酸标准物质的相对标准不确定度

由标准物质、量具校准的标准不确定度分量合成标准溶液的相对标准不确定度：

3.3.3 仪器测定引入的不确定

（1）仪器数据处理系统引入的不确定度

根据仪器说明书和积分仪的一般性能指标分析，目前用于液相色谱仪峰面积积分处理的最大误差为0.2%-1%，取1%，按均匀性分布考虑，则相对不确定度为：

（2）峰面积重复测量产生的不确定度

通过重复进样进行评定，它包含试样进样量的不确定，该不确定属A类，数据见表2。

表2 重复进样峰面积测试结果

当 n=3，极差系数 C=1.69，标准不确定度：u（A）=R/C=7.3×102

相对标准不确定度：urel（A）=u（A）/A=0.0058

（3）仪器测定引入的不确定度的合成

合成苯甲酸试样处理液峰面积测量的相对标准不确定度为：

3.3.4 待测样品称量引入的不确定度

用精确至 0.01 g天平准确称取样品 10.00 g，天平的最大允许误差为±0.01 g，按均匀分布处理，其标准不确定度及相对标准不确定度分别为：

3.3.5 待测样品溶液定容引入的不确定度

A级50 mL容量瓶最大允许误差为±0.05 mL，按均匀分布处理，其标准不确定度及相对标准不确定度分别为：

3.4 回收率引入的不确定度

由于样品前处理不完全或处理过程中导致苯甲酸的损失或污染等，使用同一方法做加标回收试验，回收率结果见表3。

表3 苯甲酸加标回收率

当 n=3，极差系数 C=1.69，标准不确定度：u（Rec）=R/C=0.603%

相对标准不确定度：urel（Rec）=u （Rec）/Rec=0.0063

3.5 标准不确定度各分量汇总

3.6 合成标准不确定度

由于上述数学模型仅涉及积和商的数学关系，其合成标准不确定度可简化计算如下：

表1中Cx=104 mg/kg，则其合成标准不确定度为 ucrel（X）=0.014×104 mg/kg=1.456 mg/kg

3.7 扩展不确定度

扩展不确定可由合成标准不确定度乘以包含因子，取 k=2（置信区间 95%），得扩展不确定：U=ucrel（X）×k=1.456 mg/kg×2=2.9 mg/kg。

3.8 测定不确定度的报告

样品中苯甲酸含量为：（104±3）mg/kg，k=2。

4 结论

通过饮料中苯甲酸含量的重复性测试结果计算试验标准差，同时对测试过程产生的不确定度分量进行评估，最后计算相对合成不确定度，求出苯甲酸含量的扩展不确定度。对各分量的相对不确定度比较发现，仪器和标准物质对测定结果不确定度的贡献大，同时重复性实验和样品处理回收率对实验结果的影响也较大。因此在试验中，可以从提高样品的均匀性、仪器的精密性、操作过程的一致性等方面来提高测量结果的准确性。

[1]JJF 1059-2012测量不确定度评定与表示[S].

[2]GB/T27025-2008检测和校准实验室能力的通用要求[S].

[3]王宏萍.气相色谱法测定果汁饮料中甜蜜素含量的不确定度评定[J].化学分析计量，2012，21(3)：11-13.

[4]GB/T5009.29-2003食品中山梨酸、苯甲酸的测定[S].

[5]GB/T 23495-2009食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法[S].