白桦树皮桦木醇含量高效液相检测方法优化

李正华　王倩　白卉

摘要[目的]优化白桦树皮桦木醇含量高效液相检测方法。[方法]利用均匀试验设计筛选了白桦待分析样品的制备方法，测定了距地面不同高度位置白桦树皮中桦木醇的含量。[结果]在0.5～4.0 m高度范围内，距地面1.5 m处的白桦树皮中桦木醇的含量最高，为17.56%，距地面4.0 m处的白桦树皮中桦木醇的含量最低，为14.51%。整体上，不同高度位置的白桦树皮中桦木醇含量差异不显著。[结论]得到提取桦木醇样品制备的最佳条件：以100%乙醇70 ℃超声波（40 Hz， 150 W）提取白桦树皮样品60 min。

关键词白桦；桦木醇；超声波辅助提取；均匀设计；高效液相

中图分类号S792.153文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-162-02

Optimization of Determination of Betulin in Betula platyphylla Bark by HPLC

LI Zheng-hua1， WANG Qian2， BAI Hui1*

（1.Key Laboratory of Fast-growing Tree Cultivating， Forestry Research Institute of Heilongjiang Province，Harbin，Heilongjiang 150081； 2.Heilongjiang ZBD Pharmaceutical Company Ltd，Harbin，Heilongjiang 150060）

Abstract[Objective] The determination of betulin in Betula platyphylla bark by HPLC was optimized. [Method] Using uniform design， betulin content in Betula platyphylla bark at different height above ground was determined. [Result] The result showed that the betulin content was the highest of 17.56% at the height of 1.5 m ， and the lowest was 14.51% at the height of 4.0 m within the range of 0.5-4.0 m above ground， but there was no significant difference among different positions. [Conclusion] The optimal conditions for betulin extraction were explored to be ultrasonically extracted by absolute alcohol at 70 ℃ （40 Hz， 150 W） for 60 min.

Key words Betula platyphylla；Betulin；Ultrasonic extraction method；Uniform design；High-performance liquid chromatography

白桦（Betula platyphylla）是桦木科桦木属落叶乔木，在我国分布广泛[1]，尤其在东北地区白桦林约占东北森林总面积的20%，且多为纯林。白桦是我国北方的主要造林和工业用材树种，是黑龙江省重要的林木资源[2]。在白桦采伐和加工过程中，会产生树皮、枝桠、树梢等大量剩余物。在这些白桦树皮等剩余物中含有一种重要的五环三萜次生代谢产物——桦木醇，又名桦木脑、白桦酯醇[3]。该物质无毒，具有抗肿瘤、消炎、快速治愈伤口、抗过敏等功效，在食品、医药、日用化工等领域有广泛的应用[4-5]。还有研究表明桦木醇衍生物在艾滋病和癌症治疗方面亦具有巨大的潜能[6]，因此对工业用材的桦树皮等剩余物进行有效利用，将会产生较高的经济效益与社会效益。

桦木醇在白桦树皮中含量为15%～35%，桦木醇主要是以晶状沉积物的形式存在于树皮外层，且在不同部位含量差异显著，含量分布依次为：外皮含量>枝皮含量>内皮含量>芽含量>叶含量>根含量>花粉含量[7]。目前关于桦木醇的制备方法及含量的测定已有报道[8-9]，但采用这些方法前需要减压高温或用有毒性的有机溶剂进行预处理，操作时间长，对环境危害大，而关于桦木醇提取方法的研究较少。

超声波是一种弹性波，它能产生并传递强大的能量，产生空化作用，使植物细胞破裂。超声波辅助提取法是将原料保存于提取液体系中用1次超声波提取以获得待分析样品的技术方法。与常规提取法相比，超声波辅助提取法具有提取时间短、产率高、操作简单等优点，更适合样品的快速测试[10]。该研究在确定桦木醇高效液相色谱分析条件的基础上，运用均匀设计方法考察了乙醇浓度、提取时间、提取温度和超声波功率对白桦树皮中桦木醇超声波提取效果的影响，确定了用于测定桦木醇含量的白桦树皮样品的提取方法，建立了一种简单、快捷、准确的白桦树皮中桦木醇含量的测定方法，并对不同高度白桦树皮中桦木醇的含量进行了分析，为工业化提取桦木醇制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白桦树皮于2013年5月采自黑龙江省牡丹江市林口县青山林场，选择干型通直、生长一致、无机械损伤的白桦成树4株，分别在树高0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 m处取10 cm×10 cm大小的树皮，80 ℃下烘干48 h后粉碎，取平均粒径3 mm白桦皮粉末备用。

试剂：乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯。桦木醇标准品购于Sigma公司。

1.2 仪器与设备

Waters高效液相色谱仪（2487型双波长紫外检测器，美国Waters）；Allegra 64R高速冷冻离心机（美国Beckmann）；万分之一电子天平（德国Sartorius）；AS20500A型超声清洗器（天津Auto science）。

1.3 色谱条件

色谱柱：美国Thermo Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：室温；流动相：乙腈/水（体积比8/2）；流速：1.0 ml/min；检测波长：210 nm；进样量：20 μl。

1.4标准溶液的绘制

精密称取桦木醇标准品20 mg，无水乙醇定容至10 ml，作为母液。

吸取母液0.2、0.5、1.0、1.5 ml于2 ml容量瓶中，以无水乙醇定容至刻度、摇匀。按照

“1.3色谱条件”，分别对不同浓度的标准溶液进样分析，每个浓度标准溶液重复测定3次。以桦木醇的质量浓度（mg/ml）x为横坐标、峰面积值y为纵坐标进行回归计算，得回归方程y=7 315 959.835 2 x+71 574.642 9，相关系数R=0.998 7，线性范围：0.2～2.0 mg/ml。

1.5样品制备

影响植物中有效成分超声波提取得率的因素主要有提取溶剂、超声波功率、提取时间、提取温度等[11]。该研究选择了乙醇浓度、提取温度、提取时间和超声波功率进行4因素10水平的均匀设计试验（表1），以桦木醇的提取率为评价指标，探讨了超声波辅助提取白桦树皮中桦木醇的最佳条件。

精密称取干燥粉碎后0.1 g白桦树皮样品于25 ml容量瓶中，按照设计的试验条件，分别加入不同浓度的乙醇24 ml（重复3次），在相应的提取条件下提取，冷却至室温后用相应浓度的乙醇定容至刻度，静置后移取1 ml上清液至离心管中，离心（12 500 g）10 min，备用。

2 结果与分析

2.1 色谱分析

按上述试验条件对白桦树皮提取液和标准品溶液进样，得到它们的色谱分离结果（图1）。桦木醇的保留效果较好，达到基线分离，分析出峰时间较短，专属性好，有利于快速分析。

图1标准品（A）和样品（B）的色谱分离结果

2.2样品制备条件的确定

均匀设计试验结果见表1。分别以乙醇浓度（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）和超声波功率（X4）为自变量，以桦木醇提取率（Y）为因变量，应用均匀设计应用软件（3.0版）数据处理软件对设计结果进行回归分析，得回归方程如下：

Y=8.284 076 4-0.101 362 6X1+0.000 392 4X22+0.000 443 7X32-0.000 093 1X3X4，R=0.917 6

根据回归方程计算得出选定的试验条件范围内超声波提取桦木醇的最佳提取条件为100%乙醇，70 ℃，超声波功率150 W，提取60 min。

表1U*10（104）均匀设计试验条件及分析结果

2.3精密度试验

取标准品溶液每次进样20 μl，重复测定5次，桦木醇标准品的峰面积积分值的相对标准偏差（RSD）为2.38%。

2.4回收率试验

精密称取3份白桦树皮粉末，每份0.05 g，分别精密加入桦木醇标准溶液4.67 ml，按样品制备及测定方法进行定量分析，测得桦木醇加样回收率和RSD分别为97.60%、1.82%。

2.5不同高度白桦树皮中桦木醇含量测定

分析不同高度白桦树皮中桦木醇的含量，结果表明在距地面0.5～4.0 m高度的白桦树皮中均含有桦木醇，1.5 m处的白桦树皮中桦木醇的含量最高，为17.56%，4.0 m处的白桦树皮中桦木醇的含量最低，为14.51%。整体上，各高度处的桦木醇含量差异不显著（表2）。

表2不同高度白桦树皮中桦木醇的含量

取样高度∥m桦木醇含量∥%取样高度∥m桦木醇含量∥%

0.516.15±2.922.515.64±1.75

1.017.16±3.813.014.64±2.36

1.517.56±2.713.515.69±3.47

2.015.33±1.764.014.51±3.68

3 结论与讨论

（1）白桦树皮含有15%～35%的桦木醇，在白桦木材加工过程中可产生大量白桦树皮剩余物，能够作为桦木醇的较好来源，有利于桦木醇的研究和利用。建立一种高效便捷的白桦树皮中桦木醇分析方法，对研究和利用桦木醇这一次生代谢产物具有较大意义。该试验运用均匀设计法考察了白桦树皮中桦木醇的超声波提取试验条件，得到提取桦木醇样品制备的最佳条件：以100%乙醇70 ℃超声波（40 Hz，150 W）提取白桦树皮样品60 min。

（2）采用上述方法分析不同高度白桦树皮中桦木醇的含量，结果表明在0.5～4.0 m高度的白桦树皮中均含桦木醇，桦木醇含量在14.51%～17.56%之间，其含量差异不显著。整体上，白桦下部树皮桦木醇含量高于上部，即老树皮含量高于新树皮，桦木醇含量高低可能与沉积的时间长短密切有关。

参考文献

[1]

关文彬. 中国东北地区白桦林植被生态学的研究[J]. 北京林业大学学报，1998，20（4）：104-109.

[2] 郑万钧. 中国树木志[M]. 北京：中国林业出版社，1998：2024-2026.

[3] 韩世岩， 方桂珍， 李珊珊，等. 四氢呋喃-苯混合溶剂法分离纯化桦木醇[J]. 林产化学与工业， 2005， 25（S1）：129-132.

[4] KASHIWADA Y，CHIYO J. 3， 28-Di-O-（dimethylsuccinyl）-betulin isomers as anti-HIV agents[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters， 2001， 11：183-185.

[5] 祁逸梅. 长白山白桦树皮中白桦脂醇的提取、衍生化及生物活性研究[D].长春：东北师范大学， 2005.

[6] ZHANG Y H，YU T，WANG Y. Northeast extraction of betulin from bark of betula platyphylla by supercritical carbon dioxide extraction[J]. Journal of Forestry Research， 2003， 3：43-44.

[7] 范桂枝，詹亚光，王博，等. 白桦不同部位及种源间白桦酯醇含量的差异分析[J]. 林产化学与工业，2007，27（4）：103-106.

[8] 李明. RP-HPLC法测定大枣中桦木醇[J]. 中草药， 2006（2）：21-23.

[9] MARIE G， JIN Y.Betulin isolation from birch bark by vacuum and atmosphericsublimation. A thermogravimetric study[J]. Thermochimica Acta，2003，8：153-166.

[10] 秦彦杰， 张玉红， 王洋， 等. 黄檗中生物碱含量的高效液相色谱分析[J]. 林产化学与工业， 2004， 24（S1）：115-118.

[11] 景谦平， 尉芹， 董娟娥. 影响植物有效成分提取的因素评述[J]. 西北林学院学报， 2001，16（3）：29-33.