生物传感器探针在致病菌检测中的研究进展

刘敏 李国鹏 张文征

摘要食源性致病菌是食源性疾病发生的主要病因，成为目前较为突出的公共卫生问题之一，因此食品污染的快速检测具有重要意义。生物传感器为人们提供更加快速、可靠和灵敏的检测平台。该研究综述了近年来几种生物传感器探针在食源性病原微生物检测中的广泛应用，客观地评价了各种探针的优缺点。

关键词生物传感器；探针；噬菌体；食源性致病菌

中图分类号S509.9文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-001-03

Research Progess on Biosensor Probes for Detection of Food-Borne Pathogen

LIU Min， LI Guo-peng， ZHANG Wen-zheng

（Laiwu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Laiwu， Shandong 271199）

AbstractFoodborne pathogens are a major reason for food-borne disease， which have caused severe impact on society health. Therefore， rapid early detection of food contamination is relevant for the containment of pathogens. Biosensors have provided rapid， reliable and sensitive detection platforms. This review summarizes the extensive application of several biosensor probes for detection of foodborne pathogens， and critically outlines their advantages and disadvantages.

Key words Biosensors； Probe； Bacteriophage； Food-borne pathogens

食源性致病菌是食源性疾病发生的主要病因，成为目前较突出的公共卫生问题之一，因此食品污染的快速检测具有重要意义。传统的病原菌检测方法例如选择性增菌和生化鉴定费时费力，免疫学或分子生物学技术需要复杂的样品制备，并且不容易实现迷你化以便于即时检测。近年来，生物传感器的研究有望克服这些限制。这项技术为人们提供了更加快速、可靠和灵敏的检测平台。目前，生物传感器的研究热点在于开发新的生物学识别元件，提高目标菌的选择性，并促进结合。噬菌体作为一种特异的生物，表现出杰出的宿主识别功能，被用作病原体检测的识别探针。笔者综述了近来噬菌体作为一种灵敏特异的生物传感器探针在食源性病原微生物检测中的广泛应用，客观地评价了噬菌体区别于其他识别探针的优缺点。

1生物传感器的定义

生物传感器是将特定的生物识别转化为可测量的信号的分析设备。它具有高度的灵敏性和特异性，可直接应用于加工食品的病原体检测，样品制备简单，不需要费时的样品预增菌和再增菌步骤；成本效益高，准确预测食物污染的水平和种类；小型轻便化，易实现原地实时检测，缩短检测耗时。典型的传感器具有3个相关的部分，即由能特异性识别的生物探针组装而成的传感器平台，将目的物分析捕获情况转换成可测量信号的转换平台，放大和加工信号成为分析捕获的量化的放大器。

2识别元件

生物探针是生物传感器最重要的部分，决定了对病原菌检测的识别特异性。理想的生物探针应当是稳定性高，在传感器平台上易固定化，特异性识别目标物，与干扰病原体的交叉反应最小。生物传感器用于病原体检测的流行的生物探针包括核酸、抗体、噬菌体、噬菌体展示肽（PDP）和新兴的噬菌体受体结合蛋白（RBP）。

2.1核酸

脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和肽核酸（PNAS）是已开发应用的分子探针。基于DNA的分子探针的主要优势是利用PCR来扩增病原体目标DNA序列，以此来增强检测平台上分子杂交的信号。RNA同样可以利用RNA聚合酶，通过反转录扩增聚合酶链反应（RT-PCR），达到类似效果。另外，肽核酸是DNA模拟物，通过序列特异性碱基互补配对，显示与DNA或RNA的高亲和力，由于其改良的结合特性和物理稳定性能够避免化学和生物降解，被视为DNA或RNA探针的可靠替代品。使用PNAS作为生物探针是一种相对较新但发展迅速的病原体检测方法，但其应用研究受探针合成的高成本限制。基于DNA和RNA的检测方法简单，稳定，灵活，快速，节约成本。此外，基因芯片技术[1]和多重PCR [2]的发展提供了复杂食品基质中同时检测多种病原体的机会。此外，核酸探针（特别是DNA）在多种溶剂[3]和缓冲液中高度稳定。这有利于在更广范围食品样品中的应用。

虽然核酸探针检测系统在病原体识别中非常流行，但它的缺点限制了其应用。基于PCR的扩增方法严重依赖于模板核酸的纯度，易污染，导致假阳性结果。同样，模板的降解核酸可能会导致假阴性结果。一个基于链接酶反应的衣原体检测系统在2003年从美国市场召回。由于结果[4]的重复性问题，核酸探针检测系统也无法辨别细菌的存活状态，因而不能真正反映样品中的细菌污染情况。此外，这些系统不能被用于检测某些细菌产生的毒素。

2.2抗体

由于抗体易固定在传感器表面，识别目标物质特异性水平高，抗体作为生物探针用于病原体检测已被广泛地探讨。多克隆和单克隆抗体、抗体片段、重组抗体已被成功地用于检测病原体、孢子和毒素以及病原体的免疫磁性分离[5]。酶联免疫吸附试验（ELISA）是抗体检测最常用的方法，已成功地与其他生物传感器平台相结合。基于PCR的目标扩增和基于ELISA的检测特异性也被合并为PCR-ELISA以获得更佳的检测限。佩雷勒等[6]将PCR-ELISA法成功地用于牛奶、肉类样品中5种沙门氏菌的检测。Abs也同样被集成到基于光学、电化学、质谱、磁、声波[7-11]的检测平台，用于临床标本中病原菌的检测。

然而，抗体作为生物探针，高度依赖于物理（温度、pH）、化学和酶条件。它们必须低温冷藏，有效期短。这限制了它们在实验室外条件下的应用。多克隆抗体有多个识别表位，易发生交叉反应，而单克隆抗体具有单一的抗原表位，但生产成本较高。抗体的生产需要免疫动物。这涉及动物实验的伦理问题。拜恩等[12]最近讨论了抗体型传感器检测病原体和毒素的原理以及存在的问题和潜在的应用。

2.3噬菌体

噬菌体是专性寄生生物，缺乏自己的代谢机制。噬菌体结合到宿主菌，将它们的DNA注入宿主中，利用宿主来增殖新的病毒，新的病毒颗粒能够裂解细菌，感染新的宿主（裂解性噬菌体），或将其基因组整合到宿主DNA中，保持休眠状态，直到激活复制和传播。大多数噬菌体严格依赖细菌的变异水平识别宿主。除了少数例外，如李斯特菌噬菌体A511可识别、结合并杀死在整个菌属[13]，而有些噬菌体可表现物种间的结合能力。据估计，1031的噬菌体存在于环境中。这提供了一个独特的识别元素，可以将其应用于生物传感器进行细菌鉴定。

2.3.1

野生型噬菌体。

噬菌体结合目标病原体的固有能力已被利用来设计生物传感器表面的物理和化学修饰。通过物理功能很容易实现表面吸附，但所提供的固定化密度不一致且不稳定。化学修饰由于多种优势而被较广泛利用。裂解性噬菌体物理吸附已被用于检测脱脂牛奶中金黄色葡萄球菌（检测限104 CFU/ml）[14]和沙门氏菌[15]。同样，对糖和氨基酸的物理吸附的噬菌体酸改性的金表面[16]以及表面改性的二氧化硅粒子[17]病原体捕获也有文献报道。将噬菌体与单克隆抗体的结合强度相比，发现在大肠杆菌检测中，噬菌体比单克隆抗体具有相似或更好的亲和力[18]。

2.3.2

工程噬菌体。

基因工程为在生物传感器中建立新的识别探针提供更大可能。下面的部分将讨论转基因噬菌体作为生物探针在病原体检测中的应用前景。

2.3.2.1

噬菌体展示肽。

噬菌体有在其表面上展示多肽或蛋白质的独特能力。这项技术是在1985年[19]首次发现。展示的蛋白质或多肽能够亲和各种目标物如碳水化合物、蛋白质、小分子或完整的细胞。基本原理是将编码目的多肽或蛋白质的基因融合到噬菌体表面蛋白编码基因中，使得混合蛋白在噬菌体表面表达[20]。λ，M13，F1，fd，T4和T7噬菌体被广泛用于噬菌体展示技术。利用噬菌体库筛选出感兴趣的目标物，未结合的噬菌体被冲走，紧密结合的噬菌体洗脱、扩增作为目标物的探针使用。针对不同目标物的多肽、蛋白质、抗体或抗体片段等已成功地表达于噬菌体表面，并且在病原体检测生物传感器中应用[21]。史密斯等[22]总结了噬菌体展示技术的基本模式和技术细节。

噬菌体展示技术不仅使肽和蛋白质特异性识别，并捕获病原体，也被利用来将生物探针固定到生物传感器平台。热尔韦等[23]展示了一个头部固定的T4噬菌体，T4噬菌体在头部区域表达生物素，固定在链霉亲和素包被的金基板，暴露尾部来特异性捕获大肠杆菌。噬菌体的定向固定化也可以通过在它们头部和尾部的物理性质的差异加以研究。研究表明，突变体的噬菌体头部带有负电荷，而尾区带有正电荷[24]。这个电荷差被用来通过静电作用与感染李斯特氏菌、大肠杆菌的噬菌体上的正电荷纤维素膜结合[25]。噬菌体特性的这种细微差别对于传感器平台的广泛应用具有非常重要的意义。

2.3.2.2

报告噬菌体。

报告噬菌体是转基因噬菌体。利用报告基因载体，通过感染，引入目的基因到宿主菌中。报告基因引入到宿主染色体，编码表达一种荧光物质或依赖比色标记的底物，从而进行病原鉴定。噬菌体任何生理功能都依赖宿主，本身无法表达报告基因，直到感染宿主，从而通过报告基因表达来确定宿主菌的存在。原核和真核细胞荧光素酶表达基因（Lux和Luc）、大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）、细菌冰核基因（inaw）和绿色荧光蛋白基因（gfp）已经有所应用。

报告噬菌体技术已被成功地用于识别多种病原体，包括大肠埃希菌[26]、分枝杆菌[27-29]、沙门氏菌[30]、金黄色葡萄球菌[31]、单核细胞增生李斯特氏菌[32]。卢瑟纳等[33]成功地使用报告噬菌体检测乳清干酪、巧克力布丁和白菜中的李斯特氏菌，对更多的微生物复合食品样品如肉末、软奶酪用相同的方法检测，检测限达10个菌/g。与4 d的常规的微生物学方法相比，总的检测时间约为24 h。报告噬菌体最大的优势是能够区分活的和死的细菌，因为噬菌体将不能在死的细菌中感染和表达报告基因。然而，报告噬菌体也会受到限制，如由于DNA限制修饰系统[34]、噬菌体抑制基因[35]、抗病毒细菌免疫系统[36]的存在，噬菌体增殖受到抑制。

2.3.2.3

噬菌体受体结合蛋白（RBP）。

最近的研究发现，噬菌体的RBP可作为一种新型的病原检测探针。一些噬菌体RBP具有独特的宿主尾部识别特异性，能识别宿主尾部纤维。这些蛋白质的结合可触发噬菌体将遗传物质插入宿主[37]。噬菌体的RBP还具有对宿主菌表面蛋白质或糖[38]序列的独特的识别能力。近来基于基因组信息学的进步，利用分子生物学方法克隆RBP的特异识别基因，将感兴趣的基因组克隆、转染、表达出感兴趣的蛋白质。这些进步已大大促进了噬菌体技术的发展[39-40]。RBP还提供了对环境条件良好的稳定性，如pH、温度和电阻稳定性[39]。最重要的是，合适的标签可以被添加到适当的序列位置，并不改变它们的结合亲和力，这样的标签可被用于生物传感器平台表面官能化基团的构建。辛格等[41]研究了半胱氨酸标记的噬菌体RBP在鼠伤寒沙门氏菌的检测中的应用，结果表明半胱氨酸标记的RBP能够有效地捕捉细菌。

3 展望

噬菌体探针应用潜力巨大，但由于宿主特异性太强（高达血清水平），潜在目标范围窄。这限制了它在病原体生物传感器中的开发应用。从生物的角度来看，宿主/目标的选择性是非常可取的。这意味着同一检测平台需要几种不同的识别探针，以识别所有细菌的致病性血清型。授予噬菌体多价性成为设计能同时检测多种病原体的生物传感器的关键因素，有待开发。另外，笔者从事食品中微生物检测工作多年，发现一些复杂基质的食品样品中常由于特殊物质而影响致病菌检测，存在巨大的食品安全隐患，因此利用噬菌体生物传感器来检测此类食品中致病菌具有较大的应用价值。

43卷7期

刘 敏等生物传感器探针在致病菌检测中的研究进展

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