植物体细胞胚发生miRNA研究进展

许珊珊　林思祖

摘要介绍了植物miRNA的作用机制，并重点阐述了落叶松、玉米、龙眼体细胞胚发生相关miRNA的研究进展。随着miRNA的深入研究，体胚发生相关miRNA的功能验证、不同miRNA间的相互调控及对下游靶基因的调控作用研究将成为重要的研究方向，因此，了解植物体胚发生miRNA的发展现状及趋势非常重要。

关键词体细胞胚发生；miRNA；落叶松；玉米；龙眼

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-018-03

植物体细胞胚的概念源于1902年Haberlandt提出的植物细胞具有全能性，即每一个细胞都能不断分裂，进而分化形成完整的植株[1]。有关植物体细胞胚发生的研究最早是从胡萝卜贮藏根组织培养材料中观察到来自体细胞组织胚的启动和发育过程[2]。同时，由于体细胞胚发生过程与合子胚发育高度相似[3]，且其在离体条件下可人为控制收集特定发育阶段的大量材料，因此体细胞胚发生亦是研究植物胚胎发育的模式系统。目前，已有众多学者对体细胞胚发生的分子机理进行了大量研究，并分离出许多相关基因，但由于体细胞胚发生是个复杂的生物学过程，涉及一系列信号转导过程和基因表达[4]，且其发生过程中各阶段基因激活与抑制的潜在机制尚不清楚，仍不足以阐明胚胎发生机理和解决生产问题。

miRNA是一类长为21～24 nt内源的非编码的小分子RNA，广泛分布于植物基因组中。miRNA主要通过引导靶基因mRNA降解、介导翻译抑制和介导DNA甲基化等途径负向调节植物基因表达[5-9]，从而调控植物细胞分裂、组织分化、器官形态建成、激素应答与信号传导以及植物对逆境胁迫的应答[10-16]。近年研究发现，miRNA作为上层调控因子在植物体细胞胚发生过程中同样起着重要的调控作用[17]。笔者简要介绍了植物miRNA的作用机制，并主要从落叶松、玉米、龙眼等植物阐述体细胞胚发生相关miRNA研究进展。

1植物miRNA的作用机制

1.1miRNA对靶基因的剪切

miRNA 介导的靶基因剪切是其主要的作用形式，一般而言，miRNA对完全互补或接近完全互补的mRNA序列进行切割。研究表明，这种切割通常精确地发生在miRAN配对碱基的第10和11位[18]。如果miRNA合成途径中hen1、ago1、hyl1等关键基因发生突变会显著降低miRNA的含量，影响其剪切作用，导致靶基因mRNA含量升高[19-21]；相反miRNA过表达则引起靶基因mRNA的减少。

1.2miRNA的翻译抑制作用

在动物中，当RISC复合体中的单链miRNA与3′UTR不完全互补时，会通过阻断该基因的翻译过程，从而调节基因的表达。这种方式只影响蛋白的表达水平，并不影响mRNA的稳定性。目前，有关翻译抑制作用的相关报道主要见于动物中，而植物中的相关报道较少。研究表明，植物miR172可以影响靶基因AP2蛋白的积累，但不影响mRNA含量[22]。但最近研究表明，miR172对AP2的调控作用主要以剪切为主，只是低AP2浓度可以刺激AP2基因的表达[23]。因此，有关植物miRNA的翻译抑制作用有待进一步深入研究。

1.3miRNA与转录沉默

miRNA可通过影响DNA水平的甲基化或者组蛋白进而影响基因转录[24-25]。研究表明，抗miR166的PHB基因在拟南芥中过表达可以导致PHB编码区DNA的甲基化程度降低，且只有突变PHB基因植株会受此影响，野生型则不受影响。目前，这种发生在基因编码区3′端的甲基化模式对PHB的转录有何影响尚不明确[8]。

2miRNA与植物体细胞胚发生

关于miRNA在植物体细胞胚发生过程中生物合成途径的早期研究主要集中于比较miRNA在分化与未分化组织中的差异[26-27]。Luo等[26]从水稻分化和未分化的胚型愈伤组织中分离出31个miRNAs。其中，miR398在未分化的胚型愈伤组织中特异表达，而miR156在胚型愈伤组织从未分化状态向分化状态转变过程中，表达水平显著提高。通过对它们的靶标进行分析得出miR398和miR156调控的靶标分别为漆酶和SBP域结合蛋白，因此推测miRNA可能参与调节高度增殖的未分化细胞的维持，而不是朝着充分发育的体细胞胚方向分化。此外，在完全分化的体细胞胚中，胡萝卜AGO1基因的表达随着2，4-D的逐渐消耗表现出迅速上升然后又下降到几乎检测不到的变化规律，而AGO蛋白家族的存在对miRNA调控靶基因的表达是必须的，这表明在体细胞胚发生过程中miRNA的合成受到严格的调控[27]。

目前，有关植物体细胞胚发生相关miRNA的报道较少，仅有落叶松、龙眼、水稻、甜橙、玉米和棉花等。而这些研究大都是采用高通量测序的方法来比较分析胚性与非胚性愈伤组织及体细胞胚发生过程中特异表达的miRNAs。

2.1miRNA与落叶松体细胞胚发生

落叶松是针叶树的典型代表，其在体细胞胚方面的研究领先于其他针叶树种。Zhang等[28]比较了日本落叶松胚型和非胚型愈伤组织miRNA表达谱，发现共有165个miRNA有差异性表达，分别属于4个miRNA家族。其中，在胚型愈伤组织中miR171表达上调，miR159、miR169和miR172表达下调。这4个miRNA家族都属于非生物胁迫诱导，且它们所有的目标转录因子都调控与细胞分化和发育关系密切的基因，包括由miR171调控的scarecrow-like（SCL）转录因子、miR172调控的apetala2转录因子、miR159调控的MYB转录因子和miR169调控的NF-YA转录因子。愈伤组织中3个表达下调的miRNA家族同时受ABA调控，进一步揭示了日本落叶松胚性能力转化的潜在机制。在落叶松体细胞胚胎发育过程中发现了87个miRNAs，29个为针叶树特异的，来自12个家族，分别为miR946、miR947、miR950、miR951、miR1311、nfiR1312、miR1313、miR1314、miR1316、miR3701、miR3702和miR3704，而其调控的34个靶基因可能参与生长发育、抗病、AGO反馈调节等多方面遗传调控。在此过程中，72%miRNAs表达次高峰在后期单胚或早期子叶胚，在中期子叶胚最低，最高峰在后期子叶胚，分别与子叶形成、胚胎后熟、胚胎休眠的生理活动相吻合。miR397和miR408表达次高峰在PEMIII，而miR398在早期单胚，miRl56和miRl66在早期子叶胚，表明其与保持薄细胞壁、质子传递、顶端分生组织形成等调控有关[29-30]。相应的truncated分析表明，落叶松体胚发生过程中miRNA可以从两端降解，66%miRNA从3′-5′降解的频率高于5′-3′方向，且不同miRNA家族或同一家族不同成员间miRNA降解频率不同，说明落叶松miRNA降解受到复杂机制调控。miRNA异构体分析表明miRNA存在3′端腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶核苷酸添加现象，体胚中miRNA位点倾向于加C；miR397a和llemiR-7在体胚发育过程中isomiR-C较丰富，说明特异miRNA3端胞嘧啶添加在植物生长发育过程中具有生物学意义[31]。

在miRNA靶基因方面，Li等[32-33]从日本落叶送体胚中成功分离了miR159的靶基因LaMYB33、miR171靶基因LaSCL6。

2.2miRNA与玉米体细胞胚发生

在玉米胚型愈伤组织诱导过程中共检测到20个差异表达miRNA保守家族，共有78个差异表达miRNA，其中包括13个保守家族新成员，分别属于zma-miR528、zma-miR172、zma-miR167、zma-miR319、zma-miR393、zma-miR396、zma-miR397和zma-miR408 8个保守miRNA家族。RT-qPCR分析结果显示，除miR1671和miR827表达下调，其余11个miRNA均表达上调。通过降解组测序得到213个靶基因，可分为细胞组成、分子功能和生物过程3类，分别参与调节植物生长发育、转录调控、胁迫响应、激素信号传导和植物代谢途径等过程。其靶基因功能主要涉及SBP、TCP、GAMYB、ARF、F-boc和GRAS等转录因子。姚霞冬[34]研究表明，激素信号转导途径与玉米胚性愈伤组织形成显著相关，而zma-miR160、zma-miR167、zma-miR393和zma-miR394等调控的14个靶基因在该通路中表达。

2.3miRNA与龙眼体细胞胚发生

利用Solexa 测序技术从龙眼体胚发生过程中得到了Unique序列6，553，782条，其中包含367个已知的龙眼miRNAs，与其他物种相比[35-38]，获得的已知miRNAs 数量较多，说明龙眼体胚发生过程中拥有种类丰富和数量较多的miRNA 家族。龙眼体胚发生过程中sRNA 主要以24 nt 的长度为主，miRNA 的表达丰度存在巨大差异，只有少数miRNA家族大量表达，绝大部分miRNA均为低丰度表达；经过分析获得了23 个候选的新miRNA，其中有10 个miRNA 含单个基因座，另外13 个miRNA 15 具备多个基因座。同时，鉴定得到调控DlSODs的11个dlo-miRNAs，它们以裂解DlSODs mRNA的方式调控其在龙眼体胚发生过程中的转录后水平表达。这11个dlo-miRNAs分别是dlo-miR156（靶标DlCSD1a）；dlo-miR159、863-3p、1023b-3p、1223和2643（靶标DlCSD1b）；dlo- miR159、398、1171a和1171b（靶标DlCSD2a）以及dlo-miR808和2089（靶标DlFSD1a），它们在龙眼体胚发生过程中呈较大差异表达。龙眼体胚发生早期的形态建成主要是由dlo-miR3，5，10，12，13，156a，156c，397a，398b.1，398b.2，398b.3，808和2089*等miRNA共同介导的，它们均在体胚发生早期球形胚之前大量表达，晚期表达量多数下降，部分miRNA甚至不表达；dlo-miR6、160a和167a可能在龙眼体胚发生的中晚期起主要作用。dlo-miR6、160a转录水平的累积对龙眼心形胚和鱼雷形胚的形态建成可能是必须的；dlo-miR167a在龙眼子叶胚和成熟胚中起主要作用；而dlo-miR159a.1、159a.2、159c和159f在龙眼体胚发生过程中的表达均较稳定。这说明miRNAs表达的组织和时空特异性共同介导了龙眼体胚的发生[39-40]。

利用RT-PCR技术，从龙眼胚性愈伤组织中获得了4条miRNA的初级体序列，分别命名为dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a，大小分别为254、751、560、228 bp。生物信息学分析表明，dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a均含有miRNA典型的二级结构，且它们二级结构自由能远高于一般植物的平均自由能；系统发育树显示，dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR397a与拟南芥同源性很高，dlo-pri-miR166a与甜橙有很高同源性；此外，利用psRNA Target 程序预测出miR156a-1、miR156a-2、miR166a、miR397a靶基因[41]。

对龙眼体胚进行外源激素及非生物胁迫处理，发现dlo-miR156a、dlo-miR397a及其靶基因dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6均有不同的表达模式，而dlo-miR166a在整个外源激素及非生物胁迫处理过程中均未表达。dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a初级体超表达研究表明，成熟dlo-miR156a、dlo-miR166a、dlo-miR397a表达量均增加，且对于不同长度dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2，成熟dlo-miR156a表达量也有很大差异[41]。

3展望

植物体细胞胚作为研究植物胚胎发育的模式系统，其发生机理一直是研究热点。miRNA作为转录后负调控因子在植物体胚发生过程中具有重要的调控作用。目前有关植物体胚 miRNA调控作用的报道较少，仅有落叶松、龙眼、水稻、甜橙、玉米和棉花等，但这些研究也仅限于体胚miRNA 的分离与鉴定，未对miRNA在体胚发生过程中的作用进行系统研究。因此，应进一步加强体胚发生相关miRNA的功能验证、不同miRNA间的相互调控及对下游靶基因的调控作用研究，将有助于进一步阐明miRNA在植物体胚发生过程中的作用机制。

安徽农业科学2015年

参考文献

[1] HABERLANDT G.Culturversuche mit isolierten Pflanzenzellen[J].Sitzungsber Akad Wiss Wien，Math.-Naturwiss.Kl，1902，3：69-92；KRIKORIAN A D，BERQUAM D L.Experiments on the culture of isolated plant cells[J].Bot Rev，1969，35：68-88.

[2] STEWARD F C.Growth and organized development of cultured cells.III.Interpretations of the growth from free cell to carrot plant[J].American Journal of Botany，1958，45：709-713.

[3] PULLMAN G S，ZHANG Y，PHAN B H.Brassinolide improves embryogenic tissue initiation in conifers and rice[J].Plant cell reports，2003，22（2）：96-104.

[4] CHUGH A，KHURANA P.Gene expression during somatic embryogenesis-recent advances[J].Current Science，2002，83（6）：715-730.

[5] SCHAUER S E，JACOBSEN S E，MEINKE D W，et al.DICER-LIKE1：blind men and elephants in Arabidopsis development[J].Trends in Plant Science，2002，7（11）：487-491.

[6] JONES-RHOADES M W，BARTEL D P，BARTEL B.MicroRNAs and their regulatory roles in plants[J].Annu Rev Plant Biol，2006，57：19-53.

[7] BRODERSEN P，SAKVARELIDZE-ACHARD L，BRUUN-RASMUSSEN M，et al.Widespread translational inhibition by plant miRNAs and siRNAs[J].Science，2008，320（5880）：1185-1190.

[8] BAO N，LYE K W，BARTON M K.MicroRNA Binding Sites in Arabidopsis Class III HD-ZIP mRNAs Are Required for Methylation of the Template Chromosome[J].Developmental Cell，2004，7（5）：653-662.

[9] KHRAIWESH B，ARIF M A，SEUMEL G I，et al.Transcriptional control of gene expression by microRNAs[J].Cell，2010，140（1）：111-122.

[10] GU M，XU K，CHEN A，et al.Expression analysis suggests potential roles of microRNAs for phosphate and arbuscular mycorrhizal signaling in Solanum lycopersicum[J].Physiologia Plantarum，2010，138（2）：226-237.

[11] LI Y F，ZHENG Y，ADDO-QUAYE C，et al.Transcriptome-wide identification of microRNA targets in rice[J].The Plant Journal，2010，62（5）：742-759.

[12] PANG M，WOODWARD A W，AGARWAL V，et al.Genome-wide analysis reveals rapid and dynamic changes in miRNA and siRNA sequence and expression during ovule and fiber development in allotetraploid cotton（Gossypium hirsutum L.）[J].Genome Biol，2009，10（11）：R122.

[13] BANKS J A.MicroRNA，sex determination and floral meristem determinacy in maize[J].Genome Biol，2008，9（1）：204.

[14] LARUE C T，WEN J，WALKER J C.A microRNA-transcription factor module regulates lateral organ size and patterning in Arabidopsis[J].The Plant Journal，2009，58（3）：450-463.

[15] RODRIGUEZ R E，MECCHIA M A，DEBERNARDI J M，et al.Control of cell proliferation in Arabidopsis thaliana by microRNA miR396[J].Development，2010，137（1）：103-112.

[16] KONG W W，YANG Z M.Identification of iron-deficiency responsive microRNA genes and cis-elements in Arabidopsis[J].Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（2）：153-159.

[17] WU X M，LIU M Y，GE X X，et al.Stage and tissue-specific modulation of ten conserved miRNAs and their targets during somatic embryogenesis of Valencia sweet orange[J].Planta，2011，233（3）：495-505.

[18] LLAVE C，XIE Z，KASSCHAU K D，et al.Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA[J].Science，2002，297（5589）：2053-2056.

[19] VAZQUEZ F，GASCIOLLI V，CRT P，et al.The nuclear dsRNA binding protein HYL1 is required for microRNA accumulation and plant development，but not posttranscriptional transgene silencing[J].Current Biology，2004，14（4）：346-351.

[20] VAUCHERET H，VAZQUEZ F，CRT P，et al.The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development[J].Genes & Development，2004，18（10）：1187-1197.

[21] BOUTET S，VAZQUEZ F，LIU J，et al.Arabidopsis HEN1：A Genetic Link between Endogenous miRNA Controlling Development and siRNA Controlling Transgene Silencing and Virus Resistance[J].Current Biology，2003，13（10）：843-848.

[22] CHEN X.A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development[J].Science，2004，303（5666）：2022-2025.

[23] SCHWAB R，PALATNIK J F，RIESTER M，et al.Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome[J].Developmental Cell，2005，8（4）：517-527.

[24] ZILBERMAN D，CAO X，JACOBSEN S E.ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation[J].Science，2003，299（5607）：716-719.

[25] MATZKE M，AUFSATZ W，KANNO T，et al.Genetic analysis of RNA-mediated transcriptional gene silencing[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Gene Structure and Expression，2004，1677（1）：129-141.

[26] LUO Y C，ZHOU H，LI Y，et al.Rice embryogenic calli express a unique set of microRNAs，suggesting regulatory roles of microRNAs in plant post-embryogenic development[J].Febs Letters，2006，580（21）：5111-5116.

[27] TAKAHATA K.Isolation of carrot Argonaute1 from subtractive somatic embryogenesis cDNA library[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2008，72（3）：900-904.

[28] ZHANG S，ZHOU J，HAN S，et al.Four abiotic stress-induced miRNA families differentially regulated in the embryogenic and non-embryogenic callus tissues of Larix leptolepis[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2010，398（3）：355-360.

[29] 张俊红，吴涛，韩素英，等.落叶松体胚发育中 12 个针叶树特异 microRNAs 表达分析[J].林业科学研究，2012，25（4）：411-418.

[30] 张俊红，张守攻，吴涛，等.落叶松体胚发育中 5 个 miRNA 前体与成熟体的表达[J].植物学报，2012，47（5）：462-473.

[31] ZHANG J，ZHANG S，LI S，et al.A genome-wide survey of microRNA truncation and 3′ nucleotide addition events in larch（Larix leptolepis）[J].Planta，2013，237（4）：1047-1056.

[32] LI W F，ZHANG S G，HAN S Y，et al.Regulation of LaMYB33 by miR159 during maintenance of embryogenic potential and somatic embryo maturation in Larix kaempferi （Lamb.）Carr[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture（PCTOC），2013，113（1）：131-136.

[33] LI W F，ZHANG S G，HAN S Y，et al.The post-transcriptional regulation of LaSCL6 by miR171 during maintenance of embryogenic potential in Larix kaempferi （Lamb.）Carr[J].Tree Genetics & Genomes，2014，10（1）：223-229.

[34] 姚霞冬.玉米胚性愈伤组织形成过程中的 miRNA 表达分析及遗传转化[D].雅安：四川农业大学，2013.

[35] SONG C，WANG C，ZHANG C，et al.Deep sequencing discovery of novel and conserved microRNAs in trifoliate orange（Citrus trifoliate）[J].BMC Genomics，2010，11（1）：431.

[36] ZHAO C Z，XIA H，FRAZIER T P，et al.Deep sequencing identifies novel and conserved microRNAs in peanuts（Arachis hypogaea L.）[J].BMC Plant Biology，2010，10（1）：3.

[37] QIU D，PAN X，WILSON I W，et al.High throughput sequencing technology reveals that the taxoid elicitor methyl jasmonate regulates microRNA expression in Chinese yew（Taxus chinensis）[J].Gene，2009，436（1）：37-44.