生石灰对中华绒螯蟹消化酶活性及免疫功能的影响

周彤彤,常国亮,2,吴 楠,2,刘丹阳,李凌娟,蒋路遥

(1.淮阴师范学院 生命科学学院,江苏 淮安 223300;2.淮阴师范学院 江苏省特色水产繁育工程实验室,江苏 淮安 223300)

ZHOU Tong-tong1,CHANG Guo-liang1,2,WU Nan1,2,LIU Dan-yang1,LI Ling-juan1,JIANG Lu-yao1

(1.School of Life Sciences,Huaiyin Normal University,Huaian Jiangsu 223300,China)(2.Jiangsu Engineering Laboratory for Breeding of Special Aquatic Organisms,Huaiyin Normal University,Huaian Jiangsu 223300,China)

生石灰对中华绒螯蟹消化酶活性及免疫功能的影响

周彤彤1,常国亮1,2,吴 楠1,2,刘丹阳1,李凌娟1,蒋路遥1

(1.淮阴师范学院 生命科学学院,江苏 淮安 223300;2.淮阴师范学院 江苏省特色水产繁育工程实验室,江苏 淮安 223300)

实验调查了在养殖水体中施用14.99 g/m3(10 kg/亩)的生石灰后,对河蟹胃、肝胰腺淀粉酶、脂肪酶和血清T-SOD(总超氧化物歧化酶)、POD(酚氧化酶),AKP(碱性磷酸酶)、 ACP(酸性磷酸酶)的影响.研究结果表明:施用生石灰后,河蟹胃淀粉酶、脂肪酶和血清T-SOD、POD活性无显著变化(P>0.05),而肝胰腺淀粉酶、脂肪酶活性分别从1.01±0.28 U/g prot、52.3±18.5 U/g prot升高到了3.39±1.00 U/g prot和161.2±39.7 U/g prot(P<0.05),血清AKP、ACP活性分别从0.66±0.14金氏单位/100 mL、0.63±0.19 U/100 mL，升高到了1.15±0.32金氏单位/100 mL和1.10±0.33 U/100 mL(P<0.05).

生石灰; 中华绒螯蟹; 消化酶; 免疫

0 引言

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis),俗称河蟹,广泛分布于中国东南沿海的咸淡水或淡水水域中,经过近年的快速发展,现已成为我国一种重要的经济蟹类,养殖产量已从2000年的2.0×108kg增加到2012年的7.1×108kg(中国渔业统计年鉴,2013),在江苏省的兴化、泗洪等地方均已成为当地的优势或特色产业.

在河蟹养殖过程中,生石灰除清塘使用外,还是一种在河蟹生长季节经常使用的水质调节药物,一般认为,每月每亩水面用10 kg生石灰全池泼洒1～2 次,能有效地调节pH值,维持池水微碱性,生石灰还能与水中铜、锌、铁、磷等结合而减轻水体毒性,促进池底厌氧菌群对有机质的矿化和腐殖质分解,使水中悬浮的胶体颗粒沉淀,透明度增加,水质变得肥、活、嫩、爽,有利于浮游生物繁殖,保持溶氧充足、水质清新的养殖好环境,有利于促进河蟹蜕壳和生长,有利于提高商品虾、蟹的品质和价格,同时能杀死虾、蟹体表的细菌、真菌、藻类等,可防治虾、蟹的烂鳃病,蜕壳不遂症,着毛病,青苔着生和某些中毒症[1-3].

既然在河蟹养殖过程中使用生石灰后会引起水质的变化,推测会对河蟹的消化酶活性及免疫功能产生一定的影响,经检索还无这方面的有关研究报道,所以本研究拟通过调查使用生石灰后水质变化对河蟹胃、肝胰腺淀粉酶、脂肪酶活性和血清中有关免疫酶活性的影响,来探讨河蟹养殖过程中施用生石灰对为河蟹的影响,以期为河蟹养殖过程生石灰的合理使用提供一定的理论参考.

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验蟹于2013年7月取自江苏省新大运生态农业开发有限公司成蟹培育池塘,实验时挑选肢体健全、活力强的个体.

1.2 实验方法

实验在江苏省特色水产繁育工程实验室进行,实验时取蟹60只,均分为3组,即每组20只.将实验蟹在实验条件下暂养14 d,用河蟹专用人工配合饲料投喂,待适应实验室饲养条件后开始正式实验.

实验期间每组蟹饲养在一个水槽里(200 cm×60 cm×15 cm),水为曝气过的自来水,内放瓦片和塑料水草,每天傍晚19:00投饵一次,投饵量为体重的3%～5%,每天投饵时吸去残饵,每天换水约1/3,光照周期为12 h:12 h,实验期间水温控制在28±1℃.

实验前一天下午18:00取基础样(每组2只,每次取样共6只,以下取样方法相同),第二天上午9:00施用生石灰,用量为14.99 g/m3,于下午18:00第一次取样,以后两天同时间点分别进行第二次、第三次取样.取样为投饵前1h进行,将蟹置于碎冰上,迅即取出胃和肝胰腺样(约0.2 g)放入灭菌的0.5 mL离心管中,于-20℃保存,以备生化成分测定.

血清取样方法:用1 mL无菌注射器从幼蟹第二步足基部抽取血淋巴,样品取出后置4℃冰箱过夜,第二天用无菌大头针划破凝结的血块,取析出的血清置-20℃保存待测.

1.3 样品分析

胃和肝胰腺酶测定时,取样品置于5 mL离心管,加蒸馏水5 mL,用IKA分散机均浆,3 500转离心后吸取上清液用于测定,其蛋白浓度用考马斯亮蓝法进行测定;血清免疫指标测定时,取样品解冻后进行.测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所,所有指标测定均按说明书进行操作.

1.4 数据分析

数据分析采用SPSS 11.0软件,One-Way Anova进行比较分析,所有数据均表示为平均数±标准差(mean±SD).

2 实验结果

2.1 生石灰对河蟹胃、肝胰腺淀粉酶、脂肪酶的影响

施用生石灰前后,胃淀粉酶、胃脂肪酶水平变化均没有显示出显著差异(P>0.05),但肝胰腺淀粉酶、脂肪酶活性均表现出短期升高又恢复的趋势,肝胰腺淀粉酶在第一次取样时从基础样的1.01±0.28 U/g prot上升到3.39±1.00 U/g prot,差异显著(P<0.05),在后两次取样时又下降到1.50 U/g prot左右的水平,与基础样已无显著差异(P>0.05),肝胰腺脂肪酶在施用生石灰后,第一次取样时达161.2±39.7 U/g prot,显著高于基础样52.3±18.5 U/g prot(P<0.05),第二、三次取样时虽然活性值要高于基础样,但统计已无显著差异(P>0.05)(表1).

表1 生石灰对河蟹胃、肝胰腺淀粉酶、脂肪酶的影响 (单位:U/gprot)

2.2 生石灰对河蟹血清相关免疫指标的影响

施用生石灰前后,血清T-SOD(总超氧化物歧化酶)、POD(酚氧化酶)活性均没有显示出显著变化(P>0.05),而血清AKP(碱性磷酸酶)、ACP(酸性磷酸酶)均显著升高,AKP从0.66±0.14金氏单位/100 mL升高至1.15金氏单位/100 mL(P<0.05),ACP从0.63±0.19 U/100 mL升高至1.10±0.33(P<0.05),并在第二、三次取样时相对基础样仍维持在较高的水平(P<0.05)(表2).

表2 生石灰对血清免疫指标的影响

注:数据中上标a、b字母表示差异显著(P<0.05)

3 讨论与分析

在河蟹养殖水体中施用生石灰后,除了调节水质、杀死病菌的作用之外,对水体的直接作用主要是引起水体两方面的变化,一是水体pH值增加,二是使水体中Ca2+含量上升,对河蟹的直接作用也主要是由这两方面引起的.本实验中,当养殖水体施用14.99 g/m3(10 kg/亩)的生石灰后,水体(曝气过的自来水)的pH值由7.84迅速上升为9.03,1 h后降为8.84,至第一次取样前(施用生石灰9 h)已降为7.7,恢复到了施用生石灰前的水平.已知pH是影响酶活力的重要因素之一,其主要通过两种途径改变酶活力,一是改变酶与底物的结合,二是改变酶的构象.而Ca2+含量上升会引起养殖水体中钙、磷等离子比例的变化,会对河蟹的生理造成一定的影响.

甲壳动物淀粉酶、脂肪酶都有最适的pH值,大多数甲壳类动物淀粉酶的最适pH值呈偏酸性,河蟹胃、肝胰腺淀粉酶分别在pH为6.9、5.8时活性最高[4],而脂肪酶的最适pH值呈偏碱性,中国龙虾(Panulirus stimpsoni)、南美白对虾(Penaeus vannmei)胃、肝胰腺中脂肪酶活性分别在pH为7.2、7.7时最高[5,6].本研究结果表明,水体短时间的pH值,并没有引起胃淀粉酶和脂肪酶活性的变化,但肝胰腺中两种酶的活性均显著升高,其原因推测河蟹的胃是一个偏酸性的环境,为维护胃环境条件的稳定,外界水体pH值的变化后,经过河蟹一系列的生理过程,并没有引起胃中pH值发生变化,故胃中两种酶的活性也没有发生变化;而肝胰腺是河蟹的脂类代谢中心,当养殖水体加入生石灰后,通过某些生理过程导致了两种酶活性显著升高,但具体原因有待设计更精确的实验进行验证.这也表明,当养殖水体施用生石灰后,可促进河蟹脂类的代谢.

T-SOD是动物体内关键的抗氧化酶之一,是超氧自由基的天然消除剂,可以清除体内多余的自由基,而甲壳类POD是由丝氨酸蛋白酶等因子组成的PO原激活系统[7]作为识别、排斥和杀灭异物的重要免疫活性分子,参与甲壳动物抗感染主要过程.本研究结果显示,养殖水体施用14.99 g/m3(10 kg/亩)的生石灰后,短期内对血清T-SOD、POD的酶活性并没有显著影响,表明并没引起河蟹清除体内多余自由基和抗感染的能力显著变化.

本研究结果表明,养殖水体施用生石灰后,短期内河蟹血清中AKP、ACP的酶活性是增加的,并且在第3 d后仍显著高于施用前,这说明,施用生石灰可促进河蟹细胞中的物质代谢,从而促进河蟹生长,间接的提高其非特异性免疫能力,因为有研究证实,AKP是巨噬细胞溶酶体的标志酶,与机体物质代谢关系密切.它通过催化磷蛋白中磷酯键的水解,直接参与磷酸基团的转移和代谢,在体内细胞调节过程中起重要作用[8,9].而ACP 是一种磷酸单酯酶,可催化所有的磷酸单酯及磷酸基团的转移反应,在生物体内直接参与磷的代谢,亦与DNA 、RNA 蛋白质、脂质等的代谢有关.它对钙质的吸取、磷酸钙沉积、骨骼形成、甲壳素分泌与形成都发挥着重要的作用[10].

海水中不同浓度CaCl2对河蟹免疫指标的影响研究表明,当海水中CaCl2浓度达到4 g/L时,河蟹肝胰腺中的SOD、ACP和AKP酶的活性都出现了显著的下降[11],但该实验的目的是为了用化学方法进行河蟹多倍体的诱导研究,水体中Ca2+浓度远远高于本实验中的浓度,所以对于河蟹免疫指标的影响并不适宜与本实验作相应的比较.

综上分析表明,在河蟹养殖水体中施用14.99 g/m3(10 kg/亩)的生石灰不但可以调节水质,杀灭病菌,还可促进河蟹的物质代谢从而促进其生长,但本研究并没对河蟹胃中蛋白酶的影响进行调查,而蛋白质是河蟹所需的最重要营养之一,所以施用生石灰后对河蟹胃中消化酶全面的影响还需要更进一步的实验来进行研究.另外,由于自然养殖水体中许多藻类、有机物颗粒等物质的存在,在自然水体中施用同样质量的生石灰后,其对河蟹的影响会较小,这也提示在养殖过程中,施用生石灰的量可根据水质的肥瘦进行适当的调整.

[1]钱华,张建,蔡云飞.在虾、蟹养殖中应该科学使用生石灰[J].渔业致富指南,2011(18):34-38.

[2]薛勇.在虾蟹养殖中生石灰使用技术[J].渔业致富指南,2005(8):41-46.

[3]周礼敬.生石灰在池塘养殖中的作用[J].渔业致富指南,2008(1):36-37.

[4]李广丽,李思发.长江、瓯江、辽河中华绒螯蟹消化酶的初步研究[J].上海水产大学学报,1996,5(2):134-137.

[5]姜永华,颜素芬.pH值对中国龙虾消化酶活力的影响[J].动物学报,2008,54(2):317-322.

[6]沈文英,胡洪国,潘雅娟.温度和pH值对南美白对虾消化酶活性的影响[J].海洋与湖沼,2004,35(6):543-548.

[7]孟凡伦,张玉臻,孔健,等.甲壳动物中的酚氧化酶原激活系统研究评价[J].海洋与湖沼,1999,30(1):110-116.

[8]刘树青,江晓路,牟海津,等.免疫多糖对中国对虾溶菌酶、磷酸酶和过氧化物酶的作用[J].海洋与湖沼,1999,30(3):278-283.

[9]牟海津,江晓路,刘树青,等.免疫多糖对栉孔扇贝酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化歧化酶活性的影响[J].青岛海洋大学学报,1999,29(3):463-468.

[10]陈清西,陈素丽,石艳,等.长毛对虾碱性磷酸酶性质[J].厦门大学学报:自然科学版,1996,35(2):257-261.

[11]柏爱旭,聂志娟,王天神,等.氯化钙对河蟹肝胰腺中几种酶活性的影响[J].海洋湖沼通报,2013(2):62-66.

ZHOU Tong-tong1,CHANG Guo-liang1,2,WU Nan1,2,
LIU Dan-yang1,LI Ling-juan1,JIANG Lu-yao1

(1.School of Life Sciences,Huaiyin Normal University,Huaian Jiangsu 223300,China)
(2.Jiangsu Engineering Laboratory for Breeding of Special Aquatic Organisms,Huaiyin Normal University,Huaian Jiangsu 223300,China)

[责任编辑：蒋海龙]

Effects of Quicklime on the Activities of Digestive Enzymes and Immunity Function in Eriocheir Sinensis

The study was conducted to investigate effects of quicklime on the activities of digestive enzymes and immunity function in Eriocheir sinensis.After 9 hour when quicklime 14.99g/m3was added into the culturing water,no significantly change was observed in amylase and lipase activities in stomach and T-SOD(total superoxide dismutasetotal) and POD(phenol oxidase)activities in serum of Eriocheir sinensis(P>0.05).Amylase and lipase activities in hepatopancreas significantly increased from 1.01±0.28 U/gprot and 52.3±18.5 U/gprot to 3.39±1.00 U/gprot and 161.2±39.7 U/gprot,respectively(P<0.05).AKP(alkaline phosphatase) and ACP(acid phosphatase)activities in serum significantly increased from 0.66±0.14 King unit/100mL and 0.63±0.19 U/100mL to 1.15±0.32 King unit/100mL and 1.10±0.33 U/100mL,respectively(P<0.05).

quicklime; eriocheir sinensis; digestive enzymes; immunity

2014-12-12

江苏省高校大学生实践创新训练计划项目(201310323037)

常国亮(1974-),男,河南濮阳人,副教授,博士,主要研究方向为水产动物养殖营养与繁殖. E-mail:changgl888@163.com

S966.16

:A

:1671-6876(2015)01-0056-04