HPLC-ELSD法测定盐酸氨基葡萄糖胶囊中盐酸氨基葡萄糖的含量

杨 淮,王崇益

(1.淮安市第三人民医院,江苏 淮安 223001; 2.江苏正大清江制药有限公司,江苏 淮安 223005)

HPLC-ELSD法测定盐酸氨基葡萄糖胶囊中盐酸氨基葡萄糖的含量

杨 淮1,王崇益2

(1.淮安市第三人民医院,江苏 淮安 223001; 2.江苏正大清江制药有限公司,江苏 淮安 223005)

采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定了盐酸氨基葡萄糖胶囊的含量.使用氨基色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相组成为乙腈:水=(7:3),流速为1.0 mL/min,在盐酸氨基葡萄糖检测含量浓度范围为0.2～1.2 mg/mL时与峰面积呈线性关系,R2为0.9999,平均加样回收率为99.86%，RSD为1.37%.该法简单,准确,无需衍生反应,精密度和重现性较好,是盐酸氨基葡萄糖胶囊含量测定的有效方法.

高效液相色谱-蒸发光散射检测法; 氨基色谱柱; 盐酸氨基葡萄糖胶囊; 含量测定

0 引言

盐酸氨基葡萄糖(分子式C6H13NO5·HCl)是甲壳素降解后生成的一种还原糖,又称D-葡萄糖胺盐酸盐(D-Glucosamine Hydrochloride,GAH),其性状为白色结晶性粉末,被广泛应用于食品、饲料添加剂、化妆品及生化细胞的培养剂中;能促进人体黏多糖的合成,在治疗骨性关节炎、溃疡、肠炎等方面具有重要作用.目前我国已经批准上市的剂型品种有盐酸氨基葡萄糖片和盐酸氨基葡萄糖胶囊.

目前常用的GAH含量检测方法有:紫外-可见分光光度法[1-2]、高效液相色谱-紫外检测法[3]、柱前衍生化-高效液相色谱法[4]和高效液相色谱-蒸发光散射检测法[5].盐酸氨基葡萄糖胶囊检测原国家标准方法采用紫外-可见分光光度法测定,该法是通过测定衍生化反应生成物的含量从而间接测定盐酸氨基葡萄糖的含量,但重复性较差,样品处理需衍生化反应,操作较为繁琐,且样品溶液的稳定性不高,测定重复性较差.高相液相色谱-紫外检测法所用测定波长为195 nm,在此波长条件下检测对流动相试剂要求较高,195 nm处于乙腈的末端吸收,故该法的灵敏度较低.检测时流动相对结果影响较大.柱前衍生化-高效液相色谱法操作复杂,实验时需要用到衍生化试剂异硫氰酸苯酯、邻苯二甲醛、3-巯基丙酸等,检测周期长,衍生化产物不稳定,且检测时衍生化试剂会在色谱系统中有较大响应.

本文选择高效液相色谱-蒸发光散射检测法,将待测物在氨基柱上进行色谱分离.具有准确、便捷、专属性强、分离效果好的特点.ELST是一种通用型质量检测器,检测不受外部环境的干扰,已越来越多应用于高效液相色谱中.对没有紫外吸收、荧光或电活性的物质以及紫外末端弱吸收的物质均能产生响应,采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定盐酸氨基葡萄糖胶囊中GAH的含量,结果准确、操作简便.

1 仪器与试药

1.1 仪器

seriesII泵(美国,Lab Alliance);Alltech 3300 ELSD蒸发光散色检测器(美国,GRACE);CA3无油空气泵(武汉科林科技公司);Hanbon Lichrospher NH2色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);HEATER AB-230A柱温箱;浙江大学N2000色谱工作站.

1.2 试剂

乙腈为色谱纯(默克,批号1716130);色谱用水为超纯水;盐酸氨基葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所,批号140649-201103)

1.3 样品

盐酸氨基葡萄糖胶囊(江苏正大清江制药有限公司,批号:130806,130807,130808).

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱NH2柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相组成为乙腈:水(7:3),流速为1.0 mL/min,柱温为35℃,检测器参数,漂移管温度为70℃,氮气为载气,压力为1.0 MP.

2.2 对照品溶液的制备

取盐酸氨基葡萄糖对照品适量,精密称定,制成浓度1.0 mg/mL的溶液作为对照品溶液.

2.3 供试品溶液的制备

精密称取盐酸氨基葡萄糖胶囊内容物,置100 mL容量瓶中,加水溶解,稀释至刻度,摇匀,制得浓度约为1 mg/mL的溶液,经0.45 μm的微孔滤膜滤过,作为供试品溶液.

2.4 阴性辅料溶液的制备

按处方比例称取辅料约100 mg,制得浓度约1 mg/mL的溶液作为阴性辅料溶液.

2.5 测定方法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液、阴性辅料溶液各20 μL分别注入液相色谱仪,测定峰面积,即得色谱图1～图3.以外标法计算被测组分含量.

图1 系统适用性对照品

图2 系统适用性供试品

图3 系统适用性阴性

2.6 线性关系

分别取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0和1.2 mg/mL不同浓度的对照品溶液,分别吸取各对照溶液20 μL,注入液相色谱仪.计算浓度值与峰面积值的线性方程及回归系数,回归方程为:y=7171696.1810x-201307.8667,相关系数R2=0.9999.实验结果表明,在0.2～1.2 mg/mL范围内,溶液浓度的值与相应峰面积值的线性关系良好.

2.7 精密度

精密吸取对照品溶液(1.0 mg/mL)20 μL注入色谱仪,重复测定5次,计算其精密度RSD为0.48%.表明试验方法精密度符合要求.

2.8 重现性

取盐酸氨基葡萄糖胶囊样品适量,精密称取相当于盐酸氨基葡萄糖100 mg的内容物置100 mL容量瓶中,制成浓度约为1 mg/mL的溶液.依此方法重复制备样品5份,20 μL注入色谱仪,RSD(n=6)为0.78%,表明试验方法重现性符合要求.

2.9 稳定性

取盐酸氨基葡萄糖对照品适量,加水制成1 mg/mL溶液,测定峰面积,分别于0,2,4,8和12 h取20 μL注入色谱仪,RSD(n=6)为1.03%.表明试验方法稳定性满足日常测定要求.

2.10 加样回收率

精密称取盐酸氨基葡萄糖适量,分别为规定量的80%、100%和120%各3份,按处方比例加相应辅料,置100 mL容量瓶中,加水溶解稀释至刻度,滤过.计算回收率.考察相对标准偏差,结果见表1.结果表明,本方法回收率良好.

表1 加样回收率试验结果

2.11 样品测定

取盐酸氨基葡萄糖胶囊3批(批号:130806,130807,130808),按照前述方法制备供试品溶液.分别取对照品溶液和各供试品溶液进样测定,以外标法计算,其3批含量分别为99.8%、100.2%和101.6%.

3 讨论

3.1 检测器的选择

虽然GAH在195 nm处有吸收,由于195 nm处于紫外检测器的末端波长,试剂纯度,流动相处理,仪器稳定性,对检测都会产生较大影响.

综上考虑,蒸发光散射检测器作为一种通用型质量检测器,可有效排除溶剂对检测结果的干扰,提高检测结果的准确性.高效液相色谱-蒸发光散射检测盐酸氨基葡萄糖胶囊含量,在合适的漂移管温度和气流下,基线稳定,分离效果好,操作简便,重复性好,测定准确,故选择蒸发光散射检测器做为本方法的检测器.

3.2 计算方法的选择

实验表明,蒸发光散射检测器的响应值与被测物浓度的关系曲线,在较高浓度范围内,大致呈线性;而在低浓度范围内,则呈指数关系.为了考察不同计算方法对准确度的影响,采用不同计算方法处理测得的值,并将结果进行对比.分别列举了用外标两点法直线方程、外标两点法对数方程.结果表明外标法在实验线性范围内检测数值与用外标两点法直线方程、外标两点法对数方程测得结果误差不大,为了方便计算故采用外标法计算含量.

3.3 色谱柱的选择

GAH为一种单糖,极性大,在C18色谱柱中几乎不保留,通过调节pH呈酸性的情况下,可以使GAH在C18色谱柱中的保留得以加强,然而其改善并不明显.NH2色谱柱可以显著增加GAH在色谱柱上的保留时间,所以NH2色谱柱较C18色谱柱在GAH分离方面更具备优势.

3.4 其他因素对检测结果的影响

蒸发光散射检测器在使用过程中气体压力的波动会对检测结果产生影响,因此实验要求气体流速和压力要相对稳定,如果气源是多台仪器共享,当支流气体流速变小时,对检测器测定的峰面积会有影响.选用空气泵做蒸发光散射检测器气源要控制空气泵输出的气压值波动不能超过±0.05 MPa.

[1]中华人民共和国国家药典委员会.国家标准 WS1-(X-090)-2005Z[S].北京:中国标准出版社,2010.

[2]王维,尤瑜敏,周培根.D-氨基葡萄糖测定方法比较[J].食品研究与开发,2003,24(2):84-87.

[3]李璟,李志伟,王立峰.HPLC法测定盐酸氨基葡萄糖口腔崩解片中盐酸氨基葡萄糖的含量[J].河北医科大学学报,2010,31(1):69-71.

[4]廖栩,王淑君,佟岩,等.柱前衍生化法测定盐酸氨基葡萄糖软膏的含量[J].沈阳药科大学报,2011,28(5):380-383.

[5]吴虹,顾宏霞,王效山.HPLC-ELSD测定盐酸氨基葡萄糖含量[J].安徽中医学院学报,2008,27(2):41-43.

[责任编辑：蒋海龙]

Determination of Glucosamine Hydrochloride in Glucosamine Hydrochloride Capsules by HPLC-ELSD

YANG Huai1,WANG Chong-yi2

(1.Huaian Third Peoples Hospital,Huaian Jiangsu 223001,China)
(2.Jiagsu Chiatai Qingjiang Pharmaceutical CO.,LTD,Huaian Jiangsu 223005,China)

To establish a high performance liquid chromatography-scattering detector(HPLC-ELSD)method for the Glucosamine Hydrochloride in Glucosamine Hydrochloride Capsules.The HPLC-ELSD was performed on a NH2column (250mm×4.6mm,5μm).The mobile phase was a mixture of acetonitrile and water (7:3).The flow was 1.0mL/min.Within the range of 0.2～1.2mg/mL,there was a good linear relation between the concentration and peak area of glucosamine hydrochloride (R2=0.9999).The average recovery was 99.86% (RSD=1.37%).This method is simple,accurate,specific,reproducible,and it has not derivation.It can be applied to determine the content of Glucosamine Hydrochloride in Glucosamine Hydrochloride Capsules.

glucosamine hydrochloride capsules; NH2Column; HPLC-ELSD Content; determination

2014-11-29

王崇益(1976-),男,江苏淮安人,工程师,主要从事药品质量检测. E-mail:1026844919@qq.com

R927.2

:A

:1671-6876(2015)01-0048-04