干酪乳杆菌发酵废弃烟梗制备L-乳酸操作参数的优化

朱大恒，杨增光，张可可，丁腾阁，张绵绵，邹春阳，闫晓静，王婧芬，贾英勃，席宇

郑州大学生命科学学院，郑州高新技术产业开发区科学大道100号 450001

干酪乳杆菌发酵废弃烟梗制备L-乳酸操作参数的优化

朱大恒，杨增光，张可可，丁腾阁，张绵绵，邹春阳，闫晓静，王婧芬，贾英勃，席宇*

郑州大学生命科学学院，郑州高新技术产业开发区科学大道100号 450001

采用单因子试验研究了6个操作参数（发酵方式、发酵时间、装载量、接种量、发酵温度及初始pH）对干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）XJL发酵废弃烟梗制备L-乳酸的影响。根据单因素试验结果，选取接种量、装载量、初始pH及发酵温度进行四因素三水平正交试验。结果表明：①初始pH、接种量和装载量对L-乳酸的产率影响显著。②最优操作参数组合为初始pH 7.0、装载量120/250 mL（250 mL的锥形瓶装载120 mL的废弃烟梗提取液）、接种量（种子液的移入体积与接种后培养液体积的比例）7.5%、37℃静置培养48 h；此条件下，废弃烟梗发酵产L-乳酸可达157.50 g/kg。

乳杆菌；L-乳酸；烟梗；操作参数；发酵

Keywords:Lactobacillus；L-lactic acid；Tobacco stem；Operational parameter；Fermentation

乳酸作为一种重要的化工原料，可通过生物或化学途径转化成一系列具有重要用途的衍生物，如乳酸酯、丙酮酸、丙烯酸和聚乳酸（PLA）等［1-2］。聚乳酸及其改性产品是可生物降解的新型高分子材料，在农、林、渔、工、医等领域应用广泛［3］。在烟草行业，添加乳酸能够有效降低卷烟烟气的pH，提高凝聚性和舒适性，改善卷烟的抽吸品质［4-5］。目前，微生物发酵法是生产乳酸的重要途径；随着市场需求量的日益扩大，寻求工农业废弃物等廉价发酵底物，降低发酵成本已成为乳酸工业的一个研究热点［6-9］。

烟梗是烟叶加工过程中产生的废弃物［10］，其中仅有40%左右通过造纸法再造烟叶等技术被有效利用［11］，大量的废弃烟梗造成了资源浪费和环境污染。烟梗中含有大量水溶性糖类和硝酸盐等［12-13］，因此对废弃烟梗进行资源化利用具有重要意义。目前，以废弃烟梗为主要原料制备活性炭［14-15］、木质陶瓷［16-17］、吸附剂［18-19］及人工草炭［20］等已有报道，但上述研究主要集中在对废弃烟梗中质量分数不到20%的粗纤维组分的利用方面［12］，综合利用程度不高。废弃烟梗中的可溶性成分可作为廉价底物通过微生物发酵制备生物杀虫剂［21］、酵母菌［22］、真菌吸附剂［23］等。朱大恒等［24-26］分离的一株干酪乳杆菌XJL能够发酵废弃烟梗制备L-乳酸，发酵过程中的操作参数可对结果产生重要影响。因此，对影响XJL发酵制备L-乳酸的6个主要操作参数进行了优化，获得了发酵的最佳操作参数组合，以期为L-乳酸的规模化制备提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

废弃烟梗由河南天昌烟草国际有限公司提供，长度为0.2～5.0 cm，直径为0.15～0.50 cm。

琼脂粉购于美国Sanland公司，其余试剂均为国产分析纯。

SHZ-D循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；JJ300电子天平（感量0.001 g，常熟双杰仪器厂）；PHS-3C pH计（上海鹏顺科学仪器有限公司）；HZQ-X100恒温摇床（太仓市实验设备厂）；XFH-50CA电热式压力蒸汽灭菌器（浙江新丰医疗器械有限公司）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；GHP-9160隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；SBA-40D生物分析传感仪（山东省科学院生物研究所）。

1.2 方法

1.2.1 菌株及培养基

干酪乳杆菌XJL为本实验室分离鉴定的一株可发酵废弃烟梗产L-乳酸的菌株［24］，XJL的保存和活化均采用MRS固体培养基［27］，琼脂的质量分数为1.8%。L-乳酸的发酵制备采用废弃烟梗提取液（Tobacco stem extraction,TSE）培养基，其制备方法参考文献［24］进行，培养基灭菌条件均为115℃灭菌20 min。TSE的初始pH采用4 mol/L的盐酸溶液或5 mol/L的氢氧化钠溶液进行调节，采用精密pH计进行测量。

1.2.2 L-乳酸的发酵制备及操作参数的优化

采用在250 mL锥形瓶中发酵的方法，研究不同的发酵方式、发酵时间、装载量、接种量，发酵温度及初始pH对L-乳酸产率的影响。将XJL平板培养物接种到含100 mL TSE培养液（pH 5.5）的250 mL锥形瓶中，在37℃和180 r/min的条件下培养18 h，培养物作为种子液进行发酵试验。以温度37℃、接种量5%（移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例）、装载量100/250 mL（250 mL的锥形瓶装载100 mL的TSE）、发酵时间48 h及初始pH 5.5静置发酵为基础试验条件，通过每次改变一个参数水平分别进行单因子试验。根据单因子实验结果选取对L-乳酸产率有较大影响的操作参数进行正交试验，通过直观分析和方差分析确定最佳参数条件。单因子及正交试验均设置2次重复，结果取平均值。

1.2.3 发酵液中L-乳酸浓度的测定及产率的计算

干酪乳杆菌XJL发酵仅产生L-乳酸，因此发酵后TSE中L-乳酸的浓度（g/L）采用生物分析传感仪进行测定。考虑到本研究的最终目的是资源化利用废弃烟梗，目前主要集中在如何提高发酵液中L-乳酸的浓度方面，尚未开展对发酵液中L-乳酸的提取工作，因此试验结果采用烟梗发酵制备L-乳酸的产率（g/kg）来表示。根据烟梗质量和水体积的比例为1∶10（kg∶L）时，每千克烟梗可制备7.5 L的TSE，因此每千克烟梗发酵后L-乳酸的产率（g/kg）即为发酵后TSE中L-乳酸浓度（g/L）的7.5倍。

1.2.4 数据分析

试验数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 操作参数对L-乳酸产率的影响

2.1.1 发酵方式

干酪乳杆菌是一种兼性厌氧菌，采用静置和振荡两种培养方式来比较发酵方式对产酸的影响，结果见图1。在静置培养条件下，L-乳酸的产率可达131.25 g/kg。振荡培养对产酸的影响较大，振荡转速为60 r/min时产率为127.50 g/kg，与静置培养时相差不大；随着转速的增大，产酸量明显下降，转速为120 r/min时，产率为108.75 g/kg。转速与发酵体系的溶氧有关，转速越高，溶氧相对越高［28］。试验结果表明，低溶氧条件下更有利于L-乳酸的产生。与振荡培养相比，静置培养不仅节约能耗，还可提高产酸量。因此以下试验均采用静置方式进行发酵。

图1 发酵方式对L-乳酸产率的影响

2.1.2 发酵时间

L-乳酸的产生与发酵时间有显著的关系。从图2可看出，发酵6～30 h时，L-乳酸产率从41.25 g/kg增至120.00 g/kg。随着TSE中糖的消耗及乳酸的累积，产酸速率显著下降，继续发酵至48 h时，L-乳酸的产率仅增加15.00 g/kg；发酵48 h后，产酸量基本保持不变，表明发酵达到终点，此时L-乳酸的产率为135.00 g/kg。缩短发酵周期是优化发酵过程中操作参数的重要目的之一，因此可通过菌种改良方法提高菌株的耐酸性或添加适当的中和剂来解除末端产物的抑制效应，缩短发酵周期。

图2 发酵时间对L-乳酸产率的影响

2.1.3 发酵装载量

装载量是影响发酵体系溶氧量的另一个重要操作参数，装载量越低，溶氧量相对就越高［29］。不同装载量对发酵产酸的影响结果见图3。在250 mL锥形瓶中，当装载量为120～160 mL时产酸量相对最高，产率均为135.00 g/kg。当装载量低于120 mL时产率逐渐降低，装载量越低，产率越低，装载量为60 mL时产率最低，为105.00 g/kg；当装载量为180 mL时产率又略微降低。这可能由于溶氧过小，影响菌体初期的繁殖生长，导致菌体浓度过低，因此选择合适的装载量可以有效提高产酸量。

图3 装载量对L-乳酸产率的影响

2.1.4 发酵接种量

接种量对L-乳酸产率的影响见图4。结果表明，接种量越大产率越高，当接种量在7.5%～12.5%时，L-乳酸的产率最高为135.00 g/kg；当接种量低于7.5%时，产酸量逐渐降低。这可能是由于XJL的延滞期过长造成的。然而，与12.5%的接种量相比，接种量为15%时的产酸量反而略微下降，这可能与发酵时过大的接种量导致发酵液中糖浓度略微降低有关。

图4 接种量对L-乳酸产率的影响

2.1.5 发酵温度

温度是影响菌体生长和产酸的重要环境参数，适宜的温度条件可以促进细胞的生长，提高发酵的产酸量。不同发酵温度对L-乳酸产率的影响见图5。在20～45℃范围内菌株XJL均能正常生长产生L-乳酸，低于28℃或者高于42℃，产酸均明显下降；最适宜产酸温度范围为35～40℃，37℃时产率最高，可达131.25 g/kg。这与文献［26］报道的牛链球菌的最适宜产酸温度为37℃一致。

图5 温度对L-乳酸产率的影响

2.1.6 初始pH

初始pH对L-乳酸产率的影响如图6。从图6可看出，在pH为4.5～7.5的范围内，菌株XJL均能发酵产酸，产率的最大值为135.00 g/kg，对应的pH为6.5。这与文献［8］报道的芽孢杆菌NL01的最适宜产酸pH为6.3比较接近。当pH小于5.5或大于6.5时，产酸量逐渐下降。这可能是由于该pH范围内XJL菌体生长缓慢，对糖类利用率较低，导致发酵周期内产酸过低。

图6 初始pH对L-乳酸产率的影响

2.2 正交试验的直观分析

通过对单因子试验结果分析，选取发酵温度、初始pH、接种量及装载量4个对产酸影响较大的操作参数进行四因素三水平正交试验。发酵温度、初始pH和接种量正交试验水平在单因子试验的最高值附近选择。考虑到下一步的放大试验还需要补加营养成分及中和剂等操作，因此装载量选择80、100和120 mL 3个水平。试验选用操作参数水平及试验结果的直观分析见表1。从直观分析的极差R值可看出在试验所选的水平范围内4个操作参数对产酸影响的顺序是：B＞C＞D＞A，即初始pH＞接种量＞装载量＞发酵温度，发酵产L-乳酸的最优组合为A2B3C3D3，即温度37℃、初始pH 7.0、接种量7.5%和装载量120/250 mL。

表1 烟梗发酵产L-乳酸正交试验因素水平及试验结果的直观分析①

2.3 正交试验结果的方差分析

正交试验结果的方差分析见表2，操作参数B、C和D的P＜0.01，因此初始pH、接种量和装载量对L-乳酸的产生均具有极显著的影响。表1的9组试验组合中没有最优组合A2B3C3D3，因此选择该组合进行追加试验（n=2）。结果表明，在优化的操作参数条件下，以废弃烟梗为唯一基质L-乳酸的最高产率可达157.50 g/kg。

表2 L-乳酸发酵正交试验的方差分析

3 小结

①与振荡发酵相比，静置发酵产酸量相对较高，节约能耗。②初始pH、接种量和装载量对L-乳酸产率有极显著影响，最优产酸条件为：温度37℃、pH 7.0、装载量120/250 mL和接种量7.5%；在该条件下，L-乳酸的产率为157.50 g/kg。与前期的研究结果［24］相比，L-乳酸的产率提高10.14%。③干酪乳杆菌XJL发酵产酸的温度范围较广，因此废弃烟梗可为L-乳酸的规模化发酵制备提供一种廉价的潜在基质。

［1］高超，马翠卿，许平.生物基乳酸生物转化研究［J］.生物工程学报，2013（10）：1411-1420.

［2］XU Ke,XU Ping.Efficient production of L-lactic acid using co-feeding strategy based on cane molasses/ glucose carbon sources［J］.Bioresource Technology, 2014,153：23-29.

［3］朱忠泗，刘有才，林清泉.聚L-乳酸性能、制备及其用途最新进展［J］.化工新型材料，2013（10）：184-186.

［4］王文领，王宁，宋金勇，等.反相HPLC法同时测定烟草中的甲酸、乙酸和乳酸［J］.烟草科技，2008（6）：41-43.

［5］周博，张天栋，李赓，等.乳酸和乳酸盐在卷烟保润中的应用［J］.中国烟草学报，2011,17（6）：8-12.

［6］Sánchez C,Serrano L,Llano-Ponte R,et al.Bread residuesconversionintolacticacidbyalkaline hydrothermaltreatments［J］.ChemicalEngineering Journal,2014,250：326-330.

［7］于波，曾艳，姜旭，等.聚合级L-乳酸的非粮生物质发酵研究进展［J］.生物工程学报，2013，29（4）：411-421.

［8］OUYANG Jia,MA Rui,ZHENG Zhaojuan,et al.Open fermentative production of L-lactic acid by Bacillus sp. strain NL01 using lignocellulosic hydrolyzates as lowcost raw material［J］.Bioresource Technology,2013, 135：475-480.

［9］Ghaffar T,Irshad M,Anwar Z,et al.Recent trends in lactic acid biotechnology：A brief review on production to purification［J］.Journal of Radiation Research and Applied Sciences,2014,7（2）：222-229.

［10］YANGZixu,ZHANGShihong,LIULei,etal. Combustionbehavioursoftobaccostemina thermogravimetric analyser and a pilot-scale fluidized bed reactor［J］.Bioresource Technology,2012,110：595-602.

［11］ZI Wenhua,PENG Jinhui,ZHANG Xiaolong,et al. Optimization of waste tobacco stem expansion by microwaveradiationforbiomassmaterialusing responsesurfacemethodology［J］.Journalofthe Taiwan Institute of Chemical Engineers,2013,44（4）：678-685.

［12］Sung Y J,Seo Y B.Thermogravimetric study on stem biomassofNicotianatabacum［J］.Thermochimica Acta,2009,486（1/2）：1-4.

［13］孙平，汤朝起，王军，等.烟梗人工醇化过程中主要化学成分的变化［J］.烟草科技，2014（4）：50-54.

［14］LI Wei,PENG Jinhui,ZHANG Libo,et al.Investigations on carbonization processes of plain tobacco stems and H3PO4-impregnatedtobaccostemsusedforthe preparation of activated carbons with H3PO4activation［J］.Industrial Crops and Products,2008,28（1）：73-80.

［15］LI Wei,ZHANG Libo,PENG Jinhui,et al.Preparation of high surface area activated carbons from tobacco stems with K2CO3activation using microwave radiation［J］.Industrial Crops and Products,2008,27（3）：341-347.

［16］ZHANG Libo,LI Wei,PENG Jinhui,et al.Raman spectroscopicinvestigationofthewoodceramics derived from carbonized tobacco stems/phenolic resin composite［J］.Materials&Design,2008,29（10）：2066-2071.

［17］LI Wei,ZHANG Libo,PENG Jinhui,et al.Effects of microwaveirradiationonthebasicpropertiesof woodceramics made from carbonized tobacco stems impregnated with phenolic resin［J］.Industrial Crops and Products,2008,28（2）：143-154.

［18］Ghosh R,Reddy D D.Tobacco stem ash as an adsorbent for removal of methylene blue from aqueous solution：equilibrium,kinetics,andmechanismof adsorption［J］.Water,Air,&Soil Pollution,2013,224（6）：1-12.

［19］LI Wei,ZHANG Libo,PENG Jinhui,et al.Tobacco stems as a low cost adsorbent for the removal of Pb（II）from wastewater：Equilibrium and kinetic studies［J］.Industrial Crops and Products,2008,28（3）：294-302.

［20］位辉琴，申永防，杜阅光，等.烟梗草炭在烟草漂浮育苗基质中的应用［J］.烟草科技，2013（9）：82-84.

［21］杜雷，赵高岭，席宇，等.烟梗废料固态发酵生产苏云金芽孢杆菌的适宜条件筛选［J］.烟草科技，2011（12）：69-72.

［22］吉彦龙，席宇，李敏睿，等.废弃烟梗发酵生产深红酵母的工艺条件优化［J］.烟草科技，2013（1）：77-80.

［23］席宇，高明，郭东衡，等.废弃烟梗发酵生产真菌吸附剂及其脱色作用［J］.烟草科技，2012（6）：72-75.

［24］朱大恒，张可可，陈彦好，等.乳杆菌发酵烟梗制备生物塑料前体物L-乳酸的研究［J］.烟草科技，2014（8）：78-81.

［25］Singla A,Verma D,Lal B,et al.Enrichment and optimization of anaerobic bacterial mixed culture for conversionofsyngastoethanol［J］.Bioresource Technology,2014,172：41-49.

［26］Yuwono S D,Kokugan T.Study of the effects of temperature and pH on lactic acid production from fresh cassava roots in tofu liquid waste by Streptococcus bovis［J］.Biochemical Engineering Journal,2008,40（1）：175-183.

［27］凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法［M］.北京：中国轻工业出版社，1999.

［28］毛勇，毛健，李华钟，等.溶氧控制条件对双孢菇发酵产胞外多糖的影响［J］.食品科学，2013,34（1）：155-159.

［29］孙波，徐宁.以玉米粉为原料L-乳酸高产菌株的选育和产酸条件的研究［J］.食品工业，2009（5）：6-8.

责任编辑 茹呈杰

Optimization of Operational Parameters for Preparation of L-lactic Acid by Fermentation of Waste Tobacco Stems withLactobacillus casei

ZHU Daheng,YANG Zengguang,ZHANG Keke,DING Tengge,ZHANG Mianmian,ZOU Chunyang, YAN Xiaojing,WANG Jingfen,JIA Yingbo,and XI Yu*
School of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China

Monofactorial experiments were performed to study the effects of six operational parameters, including fermentation means,fermentation duration,loading capacity,inoculum size,temperature and initial pH,on the preparation of L-lactic acid by the fermentation of waste tobacco stems with Lactobacillus casei XJL.According to the results of monofactorial experiments,four factors（inoculum size,loading capacity,initial pH and temperature）were selected and orthogonally tested at three levels. The results showed that:1）Initial pH,inoculum size and loading capacity significantly affected the yield of L-lactic acid.2）The optimum operational parameters were initial pH 7.0,loading capacity 120/250 mL（120 mL tobacco stem extraction loaded in a conical flask of 250 mL）,inoculum size 7.5%（the volume ratio of transferred inoculant solution to total culture solution after inoculation）,static culture for 48 hours at 37℃;under the above conditions,the maximum yield of L-lactic acid reached 157.50 g/kg.

TS414

A

1002-0861（2015）11-0022-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151105

2014-10-16

2015-07-21

河南省高等学校重点科研项目“干酪乳杆菌XJL发酵废弃烟梗水提取物产L-乳酸的响应面优化研究”（15B180020）；国家级大学生创新创业训练计划资助项目“干酪乳杆菌XJL发酵废弃烟梗水提取物产L-乳酸的研究”（2015xjxm208）；河南省烟草公司科技项目“烟草基质有机酸发酵与资源利用生物工程”（HYKJ201125）。

朱大恒（1965—），博士，教授，主要从事微生物工程研究。E-mail:zhudaheng2000@aliyun.com.cn;*

席宇，E-mail:microxy@126.com

朱大恒，杨增光，张可可，等.干酪乳杆菌发酵废弃烟梗制备L-乳酸操作参数的优化［J］.烟草科技，2015，48（11）：22-27.

ZHU Daheng，YANG Zengguang，ZHANG Keke，et al.Optimization of operational parameters for preparation of L-lactic acid by fermentation of waste tobacco stems with Lactobacillus casei［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：22-27.