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ANGPTL3与整合素β3在肾病大鼠足细胞共定位关系的研究

2015-07-12霞雷晓燕陈军辉崔维静罗璇刘姝娆索艳红甘肃省人民医院儿科甘肃兰州70000甘肃省中医药大学研究生处甘肃兰州70000宁夏医科大学研究生学院宁夏银川75000

中国医药科学 2015年23期
关键词:电镜整合素阿霉素

高 霞雷晓燕▲陈军辉崔维静罗 璇刘姝娆索艳红.甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州70000;.甘肃省中医药大学研究生处,甘肃兰州70000;.宁夏医科大学研究生学院,宁夏银川75000

ANGPTL3与整合素β3在肾病大鼠足细胞共定位关系的研究

高 霞1雷晓燕1▲陈军辉1崔维静1罗 璇1刘姝娆2索艳红3
1.甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000;2.甘肃省中医药大学研究生处,甘肃兰州730000;3.宁夏医科大学研究生学院,宁夏银川750001

[摘要]目的 本研究旨在了解ANGPTL3分子在肾病大鼠足细胞分布情况基础上,探讨ANGPTL3与整合素β3在足细胞分布关系。 方法 分组:正常SD大鼠20只和36只阿霉素肾病大鼠。肾病大鼠在造模第0天一次性尾静脉注射阿霉素7mg/kg造模。胶体金标记ANGPTL3检测正常及肾病大鼠足细胞ANGPTL3,电镜下观察胶体金颗粒在足细胞的分布特点。免疫荧光双标法进一步分析肾小球整合素β3与ANGPTL3的共定位情况。 结果 (1)阿霉素造模后第14天SD大鼠开始检出蛋白尿,至造模第28天蛋白尿达峰值,血脂升高显著,符合肾病特点。(2)正常大鼠肾小球几乎不表达ANGPTL3胶体金颗粒,仅在部分足细胞胞浆中可见少量表达。肾病大鼠肾小球胶体金颗粒特异表达在足细胞,但系膜细胞及内皮细胞均未见表达。高倍镜下观察可见,胶体金颗粒在肾病足细胞的足突部存在显著高表达,而在足体及突起部无明显表达。(3)荧光显微镜下可见ANGPTL3与整合素β3的荧光信号均主要集中于肾小球足细胞,分析显示良好重合现象,提示二者在足细胞有共同的亚细胞定位。 结论 ANGPTL3在阿霉素肾病大鼠中存在高表达,主要表达在足细胞的足突部位,该分子的在足细胞的表达部位与整合素β3存在重合情况。

[关键词]血管生成素样蛋白3;整合素β3;足细胞

蛋白尿是肾小球功能损伤时预后不良和病情进展的重要因素,足细胞损伤近年来被认为是导致大量蛋白尿发生的关键环节,足细胞损伤的相关分子机制研究一直方兴未艾[1]。研究发现,血管生成素家族成员与足细胞损伤关系密切,有关该家族成员与肾脏病的研究正成为新的研究热点[2-3]。血管生成素样蛋白3(angiopoietin like 3,ANGPTL3)是血管生成素家族的新成员,具有抑制脂酶活性,参与血管新生等多样功能[4],最近还发现该蛋白与肾病蛋白尿的发生有关[5-7]。

早期的研究认为ANGPTL3是孤儿配体,最近的研究显示ANGPTL3能够结合内皮细胞表面的整合素β3[8]。整合素β3是重要的粘附分子,其活化被看做是足细胞发生活动力升高及蛋白尿发生的关键信号事件[9]。动物模型是研究疾病机制的重要载体。有关大鼠足细胞中ANGPTL3的分布情况,及与潜在受体整合素β3的分布关系目前缺乏报道。本实验通过免疫电镜技术了解肾病大鼠足细胞ANGPTL3的分布特点,进而分析ANGPTL3与整合素β3在大鼠足细胞的定位关系,以期为今后开展ANGPTL3在大鼠肾病模型的信号机制研究提供分子病理学依据。

1 材料与方法

1.1材料

SD雄性大鼠,来自兰州大学医学院动物实验室,品系为Sprague Dawleyd大鼠,体重95~105g,分组:正常SD大鼠20只和36只阿霉素肾病大鼠。肾病大鼠在造模第0天一次性尾静脉注射阿霉素7mg/kg,每周检测一次24h尿蛋白含量,在造模后第28天捕杀模型大鼠进行血肾功能检测同时取肾组织进行免疫电镜,普通透射电镜和光镜等相关实验。

福尔马林及戊二醛来自Sigma公司,盐酸阿霉素来自Pfizer Inc公司,抗ANGPTL3抗体购买自R&D公司,抗Integrin β3单克隆抗体购自BD公司。

1.2组织处理

实验中所有肾组织根据检测目的不同分别给予以下3种处理:10%福尔马林固定过夜后再用梯度酒精脱水处理,石蜡包埋切片进行光镜分析;2.5%戊二醛处理后,锇酸液固定切片,普通透射电镜检查;PLP处理大鼠肾组织,振荡切片后进行免疫电镜分析。

1.3免疫电镜

按照山洪灾害防治县级非工程措施建设思路,项目建设任务主要包括8个方面:山洪灾害普查;划定危险区;编制基层防御预案;确定临界雨量、水位等预警指标;建设雨水情监测站点;配备预警设施;建设县级监测预警平台;建立群测群防体系,落实基层责任制,开展宣传培训演练。

使用PLP液对新鲜标本在冰点温度下处理6h,在震荡切片机上将处理后的大鼠肾组织切割成40μm的组织片,再使用PBS对组织片洗脱3次。洗脱后,继续在冰点条件下使用0.015%的皂角素浸泡20min,浸泡后PBS洗脱。以PBS代替一抗组为阴性对照,ANGPTL3多克隆抗体以1∶10滴度处理标本。将抗体处理的标本在4℃冰箱中过夜72h。一抗处理结束后PBS洗脱,使用兔抗山羊并偶联胶体金颗粒(直径=10nm)的二抗以1∶20滴度继续处理18h(4℃)。二抗处理结束后,常规电镜操作步骤处理标本至中性树脂包埋及标本微切割上机观察。电镜下,选取在×7000~40000不同放大倍数条件下观察肾小球不同区域,以及足细胞不同亚细胞结构域中的金颗粒分布情况。

1.4免疫荧光双标记

将阿霉素肾病大鼠及正常大鼠肾组织快速冰冻切片,经丙酮处理5min,再PBS洗脱3次后滴加正常兔血清在37℃温箱处理20min封闭交叉抗原。首先肾组织切片1∶50滴度的ANGPTL3多克隆抗体4℃冰箱过夜,次日予PBS洗脱后,FITC标记的1∶100滴度兔抗羊IgG继续37℃温箱处理1h;继续PBS洗脱,羊血清封闭标本并37℃温箱20min;除去反应后的羊血清,对标本予抗CD61(整合素β3)单克隆抗体滴度1∶100,37℃温箱处理1h,PBS洗脱后滴加Rhodamin标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶100),37℃温箱继续处理1h;PBS洗脱后,缓冲甘油封片,免疫荧光显微镜下读片拍照。

1.5统计学分析

2 结果

2.1肾病大鼠模型基本情况

SD大鼠在7mg/kg阿霉素一次性注射后,一般生长状态较差,皮毛粗糙伴有脱毛,饮食较差,活动力下降,检测注射第7天现24h尿蛋白定量已高于正常值,第14天尿蛋白/肌酐大于2.0,符合大量蛋白尿诊断;对照组大鼠生长发育良好,尿蛋白检测正常。在造模第28天尿蛋白/肌酐达到峰值(24.5±6.7),在第35天开始出现明显下降,提示阿霉素一次性注射的肾病模型具有尿蛋白自行缓解的趋势。对大鼠抽取尾静脉血检测肝肾功能,发现甘油三酯水平在第14开始升高(6.12±2.12)mmol/L,第28天同样达到最高值(9.77±4.15)mmol/L,但在第35天无显著下降趋势(8.92±3.57)mmol/L。进一步取大鼠肾组织病理检查发现,7mg/kg阿霉素造模的SD大鼠肾小球在光镜下无明显病理损伤改变,电镜下可见足细胞广泛足突融合发生和部分微绒毛增生,基本符合人类肾病微小病变病的病理改变特点。具体数值见表1。

2.2ANGPTL3在正常及肾病SD大鼠足细胞的分布及变化特点

免疫电镜技术作为免疫组化和普通投射电镜技术相结合的产物,技术难度较大,但其在电镜下对胶体金的观察能够可靠的确定观察的靶分子的确切亚细胞定位,一直被作为分子病理学研究的重要工具。本研究对造模成功的肾病SD大鼠采用经典的免疫电镜技术处理后,在不同放大倍数(×7000~40000)下观察大鼠肾小球足细胞,发生阿霉素处理后的足细胞足突部位均发生不同程度的广泛融合,以金颗粒标记的靶分子ANGPTL3在肾小球的表达有高度的特异性:即仅表达于足细胞,在系膜细胞和内皮细胞均无表达。同时我们观察到,胶体金颗粒不仅密集分布于足细胞,还在同一部位的基底膜中有弥散分布。同时,在一例肾病肾小球中,发现金颗粒沿基底膜的内皮细胞侧线性沉积。

进一步亚细胞定位研究发现,胶体金颗粒在足细胞内,集中分布在足突的突起部位;在足细胞的其他部位,如胞体和胞突部位分布很少。对不同足突融合程度肾病大鼠,足细胞足突胶体金颗粒的计数分析显示,足突融合程度为50%的大鼠足细胞胶体金颗粒的表达量(1.05±0.47)金颗粒/μm远低于足突融合80%的大鼠足细胞胶体金颗粒的数量(2.15±0.65)金颗粒/μm(P<0.01),足细胞的金颗粒数与足突发生融合的程度有关。与正常大鼠足细胞相比,金颗粒数在肾病足细胞存在显著升高的现象;亚细胞定位方面,正常足细胞金颗粒主要集中在胞体部而非足突部。

2.3整合素β3与ANGPTL3在肾病大鼠肾小球的共定位情况

根据电镜观察结果, ANGPTL3在足细胞的定位特点与已报道的整合素β3在肾小球的分布相似,即主要集中在足突部位,在肾小球的其他细胞无表达。故本部分实验重点观察了这2个分子免疫荧光信号在足细胞是否存在重合。在荧光显微镜下,观察到FITC标记(绿色荧光)的ANGPTL3 与Rhodamin(红色荧光)标记的整合素β3的荧光信号均在足细胞区域有较强荧光信号,进一步使用软件Merge处理后,提示2个荧光信号叠加后呈黄色信号,提示二者有较好的重合效应,半定量分析显示,每份肾病大鼠肾小球ANGPTL3与整合素β3的荧光信号(+++~++++)均与显著强于正常大鼠表达量(+~++)的趋势。

表1 阿霉素肾病大鼠血生化指标特点(±s)

表1 阿霉素肾病大鼠血生化指标特点(±s)

时间  组别  白蛋白(g/L)  胆固醇(mmol/L)  甘油三酯(mmol/L) 尿素氮(mmol/L) 肌酐(μmol/L)第0天  实验组 27.4±3.72 2.17±0.54 0.77±0.43 9.28±1.65 20.54±4.17对照组 29.14±3.05 1.82±0.57 0.54±0.28 11.23±4.15 22.39±3.58 t 0.33 0.57 0.71 0.59 0.65 P >0.05  >0.05  >0.05  >0.05  >0.05 第14天  实验组 18.22±2.74 3.72±1.33* 6.73±2.86 8.94±3.62 24.15±4.26对照组 32.18±3.26 1.64±0.43 1.36±0.65 9.75±3.17 20.03±5.17 t 2.38 3.27 3.91 0.62 0.69 P <0.05  <0.05  <0.01  >0.05  >0.05 第28天  实验组 15.93±2.37 5.46±1.97 12.17±5.43 7.14±2.31 26.83±6.74对照组 34.19±3.67 1.69±0.38 1.08±0.33 8.23±1.75 24.57±5.83 t 2.95 4.18 4.92 0.56 0.35 P <0.05  <0.01  <0.01  >0.05  >0.05

3 讨论

近年来针对ANGPTL3的研究主要集中在脂代谢领域,认为该分子是参与脂质代谢的关键调控因素[10-12]。我们研究小组近些年在肾病综合症患儿的研究中发现,ANGPTL3不仅在肾病患儿体内存在高表达,同时还参与足细胞损伤的发生[13]。免疫电镜技术是研究分子亚细胞定位的关键技术,本研究旨在深入分析ANGPTL3在肾病大鼠足细胞的亚细胞定位特点,进而在形态学角度探讨其与整合素β3在足细胞的共定位关系,为进一步探讨二者的作用特点提供病理学基础。

本研究以直径10nm的胶体金颗粒偶联二抗以显示ANGPTL3,首次对大鼠肾小球ANGPTL3的表达情况进行了细致观察。电镜结果证实,大鼠的足细胞能够合成ANGPTL3;半定量分析:金颗粒在正常大鼠足细胞微量表达,阿霉素刺激后足细胞的金颗粒数显著增多,且,金颗粒表达量与足细胞足突融合程度有关。已知,足细胞损伤是大量蛋白尿产生的核心环节,足突融合是足细胞损伤中最常见的病理类型[14-16]。本研究结果提示,ANGPTL3与足细胞损伤呈正相关性,这与已有报道ANGPTL3与肾病患儿蛋白尿水平正相关的研究结果相印证。亚细胞定位证实,足细胞发生损伤时,ANGPTL3在的亚细胞分布也会发生改变,即由正常状态下的胞体部向足突区域迁移、浓集,说明该分子参与了足细胞损伤的发生。

众所周知,整合素是参与细胞活化、迁移的重要受体,整合素β3最近被发现在足细胞表达,并参与蛋白尿形成[17-18]。本研究发现,ANGPTL3的足细胞定位与已报道的整合素分子相似[9]。为此,我们继续探讨了2个蛋白是否的确在肾小球足细胞存在共定位可能。结果显示,在肾病大鼠肾小球ANGPTL3与整合素β3的确存在良好的信号重合现象,说明二者在足细胞具有较好共定位特点,从分子病理角度证实整合素β3可能在足细胞仍是ANGPTL3的受体途径。

在电镜观察中,我们也发现在肾病大鼠足细胞金颗粒在同一血管襻有向基底膜弥散的趋势。这一现象说明ANGPTL3在足细胞合成后有向细胞外分泌的特点。但,ANGPTL3由足细胞分泌后是否会影响滤过屏障内皮细胞功能尚缺乏报道,需要继续深入研究。

肾病综合征是儿童最常见的肾脏疾病之一,探讨其发病机制,发现新的更有效的治疗药物是儿童肾脏病领域长期以来的重要问题。ANGPTL3在肾脏足细胞的深入研究将为今后的肾病分子治疗提供新的解决思路和靶点[19]。

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[中图分类号]R692

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616(2015)23-24-04

[基金项目]国家自然科学基金地区项目(81360114);甘肃省科技厅科技攻关项目(1305TCYA035);甘肃省陇原青年创新人才扶持计划,甘组通字[(2014)4号]。

收稿日期:(2015-08-04)

Research on co-localization of ANGPTL3 and integrinβ3 in podocyte of nephropathy rats

GAO Xia1LEI Xiaoyan1CHEN Junhui1CUI Weijing1LUO Xuan1LIU Shurao2SUO Yanhong3
1.Department of Pediatrics, Gansu People's Hospital, Lanzhou 730000, China; 2.Department of Postgraduate, Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 3.School of Postgraduate, Ningxia Medical University, Yinchuan 750001, China

[Abstract]Objective To explore distribution relation of ANGPTL3 molecular and integrinβ3 in podocyte at the basis of knowing the distribution of ANGPTL3 in podocyte of nephropathy rats. Methods Groups: 20 normal SD rats and 36 adriamycin nephropathy rats. Nephropathy rats were received tail vein injection of 7mg/kg of adriamycin at one time to make models at the zero day of modeling. ANGPTL3 was marked by colloidal gold and podocyte of normal rats and nephropathy rats were detected. Distribution feature of colloidal gold particle in podocyte were observed under electron microscope. Colocalization of glomerular integrinβ3 and ANGPTL3 were further analyzed by double immunofluorescent staining. Results (1)At the 14th day of modeling of adriamycin, proteinuria was detected in SD rats and proteinuria got to the maximum at the 28th day of modeling. Rising of blood lipid was significant which accords with nephropathy features. (2) Glomerular of normal rats nearly don't express ANGPTL3 colloidal gold particle and few expressions only can be seen in parts of podocyte cytoplasm. Glomerular colloidal gold particles of nephropathy rats were specifically expressed in podocyte which were not expressed in mesangial cells and endothelial cells. By the observation under high power lens, it can be seen that colloidal gold particles were significantly highly expressed in foot processes which were not significantly highly in podosoma and processes. (3) Under fluorescence microscope, fluorescence signals of ANGPTL3 and integrinβ3 were both mainly distributed in glomerular podocyte. Analysis showed good coincidence phenomenon, which suggested that ANGPTL3 and integrinβ3 had common subcellular localization in podocyte. Conclusion ANGPTL3 is highly expressed in adriamycin nephropathy rats, mainly in foot process. Expression positions in podocyte of this molecular and integrinβ3 have coincidence phenomenon.

[Key words]Angiopoientin-like protein; Integrinβ3; Podocyte

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