针药并用对慢性高眼压兔视网膜NO 和GLU 含量的影响*

孙 河，赵晓龙

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040)

青光眼(glaucoma)以其不可逆性和高致盲性备受眼科界的关注，而视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡［1］则是其主要机制。在诱导RGCs 凋亡的诸多因素中，谷氨酸(Glu)［2］和一氧化氮(NO)［3］在视网膜中含量的变化为当前研究热点。有研究发现，即使眼压控制后视功能仍不断损失［4］，故如何有效保护视神经非常重要，中医药在改善视功能、保护视神经方面疗效独到。笔者前期就针刺、中药通窍明目IV 号分别进行了实验研究，通过影响NO、Glu 在视网膜中的含量，而对视神经有保护作用。本研究探讨针药并用对慢性高眼压兔视网膜NO 和Glu 含量的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由黑龙江中医药大学实验动物中心提供的日本纯种健康大耳白兔60 只，体重2.5 ～3.5 kg，兔龄12 ～16个月，雌雄兼用。

1.2 实验药物

通窍明目IV 号由柴胡、葛根、当归、郁金等中药按一定比例配伍而成，由黑龙江中医药大学附属一院药剂科提供中药材，并由本校制剂室负责加工的浓度为每1 ml 含生药1 g 的混悬液，保持无菌密封，冰箱4℃保存备用;西药脑蛋白水解物注射液(曲奥)由哈尔滨松鹤制药有限公司提供。

1.3 仪器及试剂

眼科手术显微镜(苏州医疗器械设备厂，型号:YZZOT);眼科显微手术器械(苏州医疗器械厂);TONG-PEN 笔式眼压计(美国Medtronic solar 公司，型号:XL);一氧化氮试剂盒(南京建成生物工程研究所);卡波姆-940(北京国人逸康科技有限公司);谷氨酸标准品(江西本草天工);戊巴比妥钠(上海化学试剂厂分装)等。

1.4 造模与分组

造模:①麻醉:实验兔以耳缘静脉注射法予以全身麻醉(2%戊巴比妥钠20 mg/kg)，并予0.4%倍诺喜眼液(盐酸奥布卡因)滴眼行局部麻醉;②高眼压造模:造膜眼抽取房水0.15 ml 后，前房内注射0.3%复方卡波姆(0.3%卡波姆和0.25%地塞米松的复方卡波姆溶液，PH 值为4)0.15 ml;③眼压监测:以Tong-pen眼压计每日行眼压监测，慢性高眼压模型标准为眼压＞22 mmHg(2.93 kPa)并维持20 天，如眼压＜22 mm-Hg (1 mmHg=0.133 kPa)，7 天后按上述方法重复注药1 次;④降眼压:慢性高眼压维持28 天后行改良小梁切除术。即制备巩膜瓣后于瓣下角膜缘切一小口，缓慢放出房水，待眼压下降后冲洗前房，清除卡波姆，并行小梁及周边虹膜切除术，术后结膜下注射地塞米松1 mg、庆大霉素0.5 万U，眼压降至正常，观察1 周。

分组:随机将60 只实验兔分出20 只作为正常对照组，其余40 只造模成功后随机分为模型组和治疗组，每组20 只。共120 只眼。

1.5 治疗方法

正常对照组不予治疗。

治疗组:①针刺治疗:双侧球后、风池及行间穴，常规消毒后，球后进针时沿眶壁刺入至眶尖部，风池、行间进针约0.5 寸(腧穴定位以中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”进行);②中药治疗:通窍明目IV 号3 g/kg·d 灌胃(根据体表面积计算法，相当于成人等效治疗量);③神经营养剂治疗:脑蛋白水解物注射液0.2 ml/kg·d，于实验兔臀部或股部肌肉注射。

模型组:①生理盐水灌胃，剂量为4 ml/kg·d;②0.9%生理盐水注射液0.2 ml/kg·d，于实验兔臀部或股部肌肉注射。

以上治疗均为每日1 次，持续1 个月。

1.6 观测指标与测试方法

治疗1 月后，采用耳缘静脉空气栓塞法处死各组动物。

NO 标本制备及测定:各组随机取10 只动物摘除眼球(20 只眼)，立即在冰上沿角膜缘剪开眼球，去除晶体、玻璃体，剥取视网膜，滤纸吸干表面水分并称重，以湿重按1:20 用冰生理盐水稀释，并用玻璃匀浆器于冰水中匀浆。组织匀浆液10 000 转/min，离心10 min，取上清液，沸水浴3 min，10 000 转/min，离心5 min，取其上清液采用一氧化氮酶法测定。

Glu 标本制备及测定:各组余下10 只动物(20 只眼)去除晶体、玻璃体后，立即用无水乙醇固定30 s。剥离视网膜并称重。转移至匀浆器加无水乙醇1 ml冰上匀浆，匀浆充分后转入离心管，4℃15 000 转/min，离心20 min。取上清液采用邻苯二甲醛柱前衍生法，高效液相色谱仪与荧光光度检测器测定样品中的氨基酸，根据氨基酸的色谱峰面积，采用外算法计算样品中的Glu 含量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 针药并用对兔视网膜NO 含量的影响

表1 各组兔视网膜NO 含量比较(±s)

表1 各组兔视网膜NO 含量比较(±s)

注:与对照组比较，▲▲P ＜0.01;与模型组比较，* P ＜0.05。

组别 眼数(n) NO(u mol/g)对照组40 22.24 ±3.68模型组 40 37.41 ±4.67▲▲治疗组 40 31.89 ±3.58▲▲＊

由表1 可见，与对照组相比，治疗组和模型组兔视网膜中NO 含量均有升高。模型组与对照组比较，视网膜中NO 的含量差异有显著性(P ＜0.01)。治疗组与模型组之间差异有显著性(P ＜0.05)。治疗组与对照组之间差异有显著性(P ＜0.01)。

2.2 针药并用对兔视网膜Glu 含量的影响

由表2 可见，与对照组比较，兔视网膜中Glu 的含量均升高。模型组与对照组比较，视网膜中Glu 的含量差异有显著性(P ＜0.01)。治疗组与模型组之间差异有显著性(P ＜0.01)，治疗组与对照组之间差异有显著性(P ＜0.01)。

表2 各组兔视网膜Glu 含量比较(±s)

表2 各组兔视网膜Glu 含量比较(±s)

注:与对照组比较，▲▲P ＜0.01;与模型组比较，* P ＜0.01。

组别 眼数(n) Glu (10 -5 mmol/g)对照组40 25.28 ±4.58模型组 40 53.01 ±6.86▲▲治疗组 40 42.58 ±4.15▲▲＊

3 讨论

NO 是体内重要的信使分子和效应分子，是近年来研究较多的一种神经递质，对眼内压和眼血流有调节作用［5］。生理状态下，NO 主要由一氧化氮合成酶催化生成，发挥神经递质的作用，但在病理状态下如创伤、缺血、细胞因子等被诱导后可产生过量NO，线粒体膜去极化，自由基生成增多，使细胞内Ca2+浓度增加，破坏呼吸链，加速能量消耗，损伤DNA，导致神经细胞死亡［6］。

Glu 是大量存在于脑部中枢神经系统中的兴奋性神经递质，具有含量最高、分布最广、作用最强等特点。生理状态下谷氨酸作为一种神经递质，传递生物信号;在病理情况下，谷氨酸大量释放而摄取减少，与视网膜神经节细胞表面的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体结合，经胞内信号传导，引起细胞内钙离子超载，并随之激活一氧化氮合成酶，诱导NO 过量生成，具有氧化特性的一氧化氮与线粒体释放的超氧阴离子结合，形成具有强毒性的过氧亚销酸根离子，致使RGCs抵抗力下降，细胞膜通透性增强，促使凋亡发生，同时，凋亡的RGCs 又释放高浓度的谷氨酸，兴奋性谷氨酸再损伤RGCs，形成恶性循环。

目前尚无确切药物对视神经保护具有明确作用，中医药治疗显示出独特的优势。通窍明目IV 号即为本课题组多年临床验方，前期临床研究表明用药后患者视力提高，视野平均光敏度增强，视野缺损面积减小，视神经电生理活动增强，同时还具有扩张外周血管、改善微循环、抗氧化、抗血小板聚集的作用［7］。实验研究中发现，其可减轻高眼压兔视网膜及视神经超微结构的损伤程度，抑制NO、Glu 的毒性作用，对视网膜抗凋亡基因Bcl-xl 和神经营养因子BDNF 的表达亦有上调作用，并可明显改善VEP 的P1 波潜伏期及振幅［8］。

针刺为祖国医药的重要部分，被视为“绿色医疗”，就其对视神经的保护作用，本课题组在大量临床研究中发现针刺可以提高患者视力，视觉诱发电位振幅也相应提高，潜伏期缩短;视野平均光敏度显著增加，平均缺损率减少;而视网膜神经纤维层的厚度影响均不明显［9］。实验研究中显示针刺治疗后视网膜增厚，外核层亦可见增厚，内核层空泡结构减少，细胞数量亦增加;兔视网膜中NO 及Glu 含量明显降低;兔节细胞BDNF 蛋白表达显色强度加强，Bcl-xl 表达阳性反应范围扩大，节细胞、视杆内节出现较强的阳性反应;节细胞层出现部分空泡，内核层及内网状层部分萎缩，视细胞内外节水肿、断裂或溶解等均有减轻。

针药结合对视神经保护的临床研究中显示，针药治疗组提高视力的有效率达86.67%，西药对照组有效率达63.33%，治疗组优于对照组;视野变化，治疗对照两组均出现平均光敏度增强、平均缺损降低;视诱发电位方面，治疗对照两组均有P100 振幅增加、潜伏期缩短。实验研究表明，针药并用可以增强视网膜上Bcl-xl 蛋白、BDNF 的表达，且优于单纯针刺组［10-11］。

青光眼归类于中医学之“五风障”，属瞳神疾病，根据其发展不同程度晚期亦可归属“青盲”、“视瞻昏渺”等范畴。笔者依据肝窍学说，认为青光眼为七情所犯，肝郁气结，气郁不得疏泄，无以助血运行，导致眼部气血瘀滞闭塞目窍，神光不得发越，致使视物昏蒙，因此以“疏肝开窍”为法，采用针刺结合通窍明目IV号及神经营养剂进行实验研究，探讨其对青光眼视神经保护的作用机制。本实验的动物模型制备采用课题组多年临床经验，即兔眼前房注射0.3%复方卡波姆溶液制作慢性高眼压模型［12］，而后采用改良小梁切除将眼压恢复正常。此种造模成功率高，造模稳定，制备方法与人类青光眼发病特点相似，为课题的顺利完成提供了保障。通过本研究证实，针刺联合通窍明目IV 号及神经营养剂综合治疗能有效减少NO、Glu 在视网膜中的含量，从而发挥其对视神经的保护作用。就其作用机理可能是通过影响视网膜微环境，改善微循环，维持其能量供给，抑制钙离子的细胞内流，减少一氧化氮合成酶的生成，阻断NO 和Glu 恶性循环的产生，阻止RGCs调亡，进而产生视神经保护作用。本研究样本基数大，但未能进行各组单一治疗及联合治疗对比，有待今后实验研究中得以进一步的完善。

［1］ NickellsRW. Retinal ganglion cell death in glaucoma:the how，the why，and the maybe［J］.Glaucoma，1996，5:345-356

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［10］ 高婷.针药并用对慢性实验性高眼压兔视网膜上BDNF、Bcl-xl表达的影响［D］.哈尔滨:黑龙江中医药大学，2010:29

［11］ 王学栋.针药并用对青光眼视神经保护作用的临床研究［D］.哈尔滨:黑龙江中医药大学，2012:41

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