茶藨子扦插生根过程中多酚氧化酶的变化

李旭霞,马明呈,李学苹

(1.青海省门源县林业技术推广中心,青海海北810300,2.青海大学,青海西宁810016)

茶藨子扦插生根过程中多酚氧化酶的变化

李旭霞1,马明呈2,李学苹2

(1.青海省门源县林业技术推广中心,青海海北810300,2.青海大学,青海西宁810016)

通过测定茶藨子扦插生根过程中多酚氧化酶(PPO)的活性,找出氧化酶活性变化与生根的联系。结果表明,插条扦插生根与酶有密切的关系;不同处理的五裂茶藨子插条的PPO活性均呈极显著差异,五裂茶藨子插条和狭果茶藨子插条的PPO活性均呈上升-下降-上升的趋势,且狭果茶藨子的PPO活性均高于五裂茶藨子。

茶藨子;扦插生根;多酚氧化酶

五裂茶藨子(Ribes meyeri Maxim.),又叫麦粒醋栗,属虎耳草科茶藨子属,落叶灌木,高1～2 m;幼枝光滑带红色,老枝灰黑色;叶多掌状五裂,边缘有单锯齿或重锯齿,基部心形,叶柄紫红色;总状花序直立,后下垂,花两性,浆果球形,黑色,无毛,有光泽。分布于青海、四川、甘肃、新疆等省区,青海产于乐都、互助、大通、祁连、门源、兴海等地。狭果茶藨子(Ribes stenocarpum Maxim.)又名长果醋栗,落叶灌木,高1～2 m;老枝灰色或灰褐色,小枝棕色,幼时具柔毛;花两性,果实长圆形浅绿色有红晕或红色。分布于甘肃、四川、陕西、青海等地,青海分布于尖扎、同仁、湟源、循化、互助、门源等地[1]。

茶藨子属植物属浆果资源,被称为第三代新型果树[2]。具有很高的营养和药用价值。茶藨子属植物果实,富含维生素A、B、C、D,可用来制造饮料及酿酒[3]。果实也可入药,具有解表之功能,水煎服,主治感冒,除此之外,它还有治疗月经不调,补血补脑,活血,降血脂等作用,并且对治疗赤白痢疾,关节炎,肾炎,维生素缺乏症效果较好[4]。茶藨子的芽、花和嫩叶用沸水冲饮,可代茶用,具有清热、明目、润肝、利尿、强心、抗菌之功能[5]。茶藨子的根、叶、果实中含有的黄酮类活性成分具有软化血管、降血脂、调血压的功能[6]。张桂兰[7]对茶藨子中的总黄酮量进行了测定,结果显示,茶藨子中总黄酮含量最高达74 mg/100g,具有软化血管、降血脂、调血压作用。另外,茶藨子中所富含的香豆素类化合物及黄酮类化合物在农药领域可用作杀虫剂、杀菌剂、植物生长调节剂等[8]。茶藨子种子所含的不饱和脂肪酸有降低胆固醇、防止动脉硬化、增强免疫力、延缓衰老等药理作用[9]。种子含油16%以上,还可榨油[10]。同时茶藨子属植物冠形整齐,花朵小巧娇艳,叶色嫩绿,叶形多样,果实晶莹剔透、颜色丰富,加之具有较强的抗寒、抗病、抗虫能力,栽培成本低,因此具有很好的观赏价值[11],也被用做园林绿化树种。可见茶藨属植物具有巨大的经济价值和显著的生态价值,开发和应用茶藨子野生植物资源具有重要的意义。

酶在植物体的生长、发育以及组织器官分化中起着重要的作用。Haissig[12]和Bouillenne等[13]的研究结果都表明,PPO与植物根的形成也有着非常密切的联系。黄卓烈[14]等对桉树等树的研究表明,容易生根的植物体内吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性较低,难生根的植物IAAO活性都较高。宋金耀[15]等试验结果表明,POD、IAAO活性及酚类物质含量与树种枝条生根有密切关系。曹帮华[16]等对桑树硬枝扦插过程中的插穗基部的过氧化物酶、多酚氧化酶、吲哚乙酸氧化酶的动态活性变化进行了研究,发现这3种酶活性的动态变化与生根过程密切相关。此外植物体内其他酶类如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等与插穗的生根能力存在一定相关性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

狭果茶藨子和五裂茶藨子的插条均来自青海互助土族自治县北山林区。统一在生长健壮的8年生母树上选取2年生硬枝插条,插条长度为10～15 cm左右。插条保留3～4个健壮芽,上切口距上芽约1 cm,下切口在芽下方0.5～1 cm处,插条采集时要完好无损。

1.2 试验设计

为了进一步的探究五裂茶藨子与茶藨子属其他种生根方面的异同,生根机理研究分为同一树种不同处理和不同树种同一处理的试验设计。同一树种不同处理:选用五裂茶藨子插条,在60 mg L-1的GGR中浸泡基部8 h,每个处理为30根,重复3次,并设清水作对照(CK)。不同树种同一处理:统一选用不作任何处理的五裂茶藨子和狭果茶藨子插条,每个树种分3次重复,每个重复为30根。统一扦插于园土(栗钙土)的苗床上。

1.3 扦插管理

苗床准备:首先对育苗地进行平整,深翻25～36 cm,施足底肥尿素150 kg hm-2,二铵187.5 kg hm-2,麻渣975 kg hm-2,然后用硫酸亚铁(300 kg hm-2)对土壤消毒,最后浅翻一遍,除去杂物、石块、残根等,进行整地,做成长10 m,宽7 m的畦田,畦田要细致平整,土壤松软度适宜。

插后管理:插完后应立即灌水或浇透水使插条与土壤紧密接触,有利于插条的成活。当土壤干燥时应及时浇水,每隔半月或1月进行中耕锄草。

1.4 指标测定及方法

扦插后,插条每隔14 d取样1次,每种处理每次随机选取10～12根,共取6次。取样时间为8:00—10:00,每次取样后放入冰盒带回实验室。观察后把插条清洗擦干,然后迅速刮取插条基部的韧皮部和少量木质,剪碎放至超低温冰箱中保存备用。由于大量的研究表明,PPO等酶的活性与插条生根过程有关,所以依据实验仪器及实验条件,本研究测定多酚氧化酶活性,同时进行相关形态观察。

采用邻苯二酚比色法测定:取植物材料0.2 g,加少量不溶性聚乙烯吡咯烷酮(事先用蒸馏水浸洗,然后过滤以除去杂质),加入预冷的磷酸缓冲液(p H6.5)10 m L,在冰浴中研磨成匀浆,在4℃下离心10 min,收集上清液保存在冷处,并用磷酸缓冲液定容,即为粗制酶液。

PPO活性测定:将1 m L(0.1 mol L-1)邻苯二酚加入4 m L磷酸缓冲液(p H6.5)中,加入1 m L酶液,迅速摇匀,立即于波长420 nm下测定吸光度的变化,每隔30 s记录1次,共记录3 min。以不加酶提取液的反应液做对照,以每分钟吸光度变化0.01为1个PPO酶活性单位。(注意空白为:2.5 m L磷酸缓冲液和0.5 m L 0.01 mol L-1邻苯二酚溶液)

酶活性(U g-1min-1)=(ΔA420×VT)/(0.01 ×W×VS×T)

ΔA420—反应时间内吸光度的变化;

VT—提取液总体积(m L);

W—为样品鲜质量(g);

VS—为测定时取用酶液体积(m L);

T—反应时间(min)。

1.5 数据处理方法

数据采用Microsoft Excel和DPS统计软件分析处理。Microsoft Excel对原始数据处理,并绘制相关图表,用DPS对数据进行方差和显著性分析,同时绘制有关图表。

2 结果与分析

五裂茶藨子不同处理后其扦插过程中插条PPO活性变化情况见表1。

不同树种同一处理扦插过程中插条PPO活性变化见表2。

对表1数据进行方差分析,结果见表3。

由表3可以看出:五裂茶藨子插条在插后不同时间PPO活性的方差分析表明:不同时间之间, GGR处理和清水对照的五裂茶藨子插条的PPO活性均呈极显著差异(P＜0.01)

表1 五裂茶藨子扦插过程中插条PPO活性变化

表2 五裂茶藨子和狭果茶藨子扦插过程中插条PPO活性变化 U g-1min-1

表3 五裂茶藨子插条插后不同时间PPO活性的方差分析结果

由图1知,对照和处理的五裂茶藨子插条内的PPO活性在生根过程中的变化趋势一致,都是升高-降低-升高,且整个过程GGR处理的PPO活性要高于清水对照。0～28 d对照与处理PPO活性显著升高,表明PPO活性升高能促进愈伤组织的发育,不同的是处理PPO活性在14～28 d期间略有降低,而对照持续显著升高。28～42 d,随着插条大量组织的形成,PPO活性都开始下降且趋势一致,这可能与插条的愈伤组织基本形成且根还处于突破皮层的阶段有关。42～70 d期间,插条内PPO活性均不断升高。此外,插条生根过程中,处理插条的PPO活性一直高于对照,说明GGR处理较早的激活了插条PPO的活性,形成较多的“IAA-酚酸复合物”,提高生根率。

图1 五裂茶藨子扦插后插条PPO活性变化

对表2的数据进行方差分析,结果见表4。

表4 五裂茶藨子和狭果茶藨子插条插后不同时间PPO活性的方差分析结果

表4可以看出,不同时间之间,不作任何处理的五裂茶藨子和狭果茶藨子硬枝插条的PPO活性均呈极显著差异(P＜0.01)

图2 五裂茶藨子和狭果茶藨子扦插后插条PPO活性变化

由图2可知插后28 d愈伤组织形成时,五裂茶藨子和狭果茶藨子插条内的PPO活性呈显著性上升,达到最大值。28～42 d,二者均显著急速降低,且狭果茶藨子又达到最小值,可见PPO活性不但参与愈伤组织的形成,而且对不定根发生起重要作用。第56 d五裂茶藨子PPO活性与42 d差异不显著,但是达到插条生长过程的谷值,而狭果茶藨子与42 d相比显著升高,这也再次证明茶藨子在根突破表皮时PPO活性是降低的,并且狭果茶藨子先于五裂茶藨子生根,在42～70 d期间,五裂茶藨子处于根向外突出到伸长的过程,而狭果茶藨子已经开始根的伸长,因此,五裂茶藨子先降低再显著升高,而狭果茶藨子持续显著升高。

3 讨论与结论PPO是一种呼吸酶,高的PPO活性可以增强呼吸作用,并抑制插条的衰老死亡,使插条保持活跃的生理状态,有利于不定根的形成。五裂茶藨子插条的对照和处理PPO均为上升-下降-上升-下降的双峰变化趋势。愈伤组织形成初期酶活性上升利于愈伤组织的形成,42 d后正值不定根形成期,此时PPO活性又开始上升,可能与促进不定根的形成有关。同时发现,经过GGR处理的插条PPO明显高于对照,这可能与生长调节剂可以促进酶的活性有关。而对没作任何处理的五裂茶藨子和狭果茶藨子插条的研究发现PPO活性呈上升-下降-上升的趋势,只有一个高峰,且五裂茶藨子PPO的活性明显低于狭果茶藨子,这可能与五裂茶藨子本身含有较低的PPO活性有关,也进一步说明狭果茶藨子比五裂茶藨子易于生根的原因。

插条扦插生根与酶有密切的关系。扦插生根过程中,五裂茶藨子对照与处理在愈伤组织和根的诱导期都呈现升高趋势,而在愈伤组织大量形成和根伸出时均呈下降。然而没作任何处理的五裂茶藨子和狭果茶藨子只有在大量愈伤组织形成时出现下降。同样,五裂茶藨子和狭果茶藨子插条的PPO活性在扦插中期呈现下降趋势,在后期趋于明显上升。在整个扦插期,狭果茶藨子酶的活性均大于五裂茶藨子酶的活性。

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Changes of Polyphenol Oxidase during Rooting of Ribes meyeri Cuttings

Li Xuxia1,Ma Mingcheng2,Li Xueping2
(1.Forestry Technology Promotion Center of Menyuan County,Qinghai Prov.,Haibei 810300,China; 2.Qinghai University,Xining 810016,China)

Activity of polyphenol oxidase(PPO)in process of rooting of Ribes meyeri cuttings were determined to find out the relationship of the changes of polyphenol oxidase and its rooting.Result shows that rooting of the cuttings have close relationship with the enzyme.PPO activity of Ribes meyeri cuttings with different treatments are significantly different;PPO activity of Ribes meyeri cuttings and Ribes stenocarpum show trend of rise-fall-rise; PPO activity of Ribes stenocarpum are higher than that of Ribes meyeri.

Ribes meyeri;rooting of cuttings;polyphenol oxidase(PPO)

S615

:A

10.13601/j.issn.1005-5215.2015.11.005

1005-5215(2015)11-0013-03

2015-09-21

国家林业公益性行业科研专项(201304812)

李旭霞(1974-),女,青海门源人,大学,工程师,从事林业科技推广,Email:1134815834qq.com

马明呈(1965-),男,教授,硕士生导师,从事经济林培育研究,Email:mmch23jop@163.com