氟代柠檬酸对骨癌痛大鼠CB2表达的影响研究

张卉,李宾,张辉

(1.河南黄淮学院 护理学系，河南 驻马店 463000；2.河南黄淮学院 生物工程系，河南 驻马店 463000；3.驻马店市中心医院 泌尿外科，河南 驻马店 463000)



氟代柠檬酸对骨癌痛大鼠CB2表达的影响研究

张卉1,李宾2,张辉3

(1.河南黄淮学院 护理学系，河南 驻马店 463000；2.河南黄淮学院 生物工程系，河南 驻马店 463000；3.驻马店市中心医院 泌尿外科，河南 驻马店 463000)

目的 研究氟代柠檬酸(fluorocitrate，FC)对骨癌痛大鼠CB2基因表达的影响及意义。方法 40只SD大鼠注射Walker-256肿瘤细胞，建立骨癌痛模型，另取10只SD大鼠作为假手术组，10只作为对照组。首先比较假手术组和骨癌痛大鼠热缩足反射潜伏期(thermal withdrawl latency, TWL)。再将骨癌痛大鼠随机分为FC组和非FC组，每组20只。FC组术后14 d注射氟代柠檬酸0.01 mL(1 nmol)，非FC组注射生理盐水0.01mL，记录大鼠机械缩足阈值(paw withdrawl mechanical threshold,PWMT)。同时采用免疫印迹法测定CB2表达结果，观察灰度值。结果 骨癌痛组大鼠TWL先缩短后恢复正常，假手术组基本保持不变，2者在第3 d具有统计学差异(P< 0.05)。FC组大鼠注射氟代柠檬酸后，PWMT值有先升高后降低现象。假手术组和骨癌痛组大鼠CB2均明显高于基础值(P< 0.05)；非FC组大鼠CB2逐渐降低，第7天和第14天时显著高于假手术组(P< 0.05)。FC组大鼠与非FC组相比，CB2在7d时有统计学差异(P< 0.05)， 14 d和21 d时略低，但差异无统计学意义。结论 患骨癌痛后，机体CB2表达会有一定程度增加，引起疼痛，而氟代柠檬酸可抑制CB2的表达，从而缓解疼痛。

氟代柠檬酸；骨癌痛；CB2

骨癌痛是骨癌患者晚期出现的症状，疼痛较严重，且目前尚无有效的治疗方法。大麻素是一组萜酚类化合物，其相应的受体有CB1和CB2两种亚型，CB2主要存在于小胶质细胞和星状胶质细胞中。有文献报道[1]CB2可能与骨癌痛的发生机制有关。本研究以骨癌痛大鼠为模型，主要探讨胶质细胞抑制剂氟代柠檬酸对骨癌痛患者CB2表达的影响。以下为研究过程回顾。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验动物许可证号 选取60只健康雌性SD大鼠，体质量150～200 g，许可证号:SCXK(苏)2002-0037。由苏州大学医学院实验动物研究中心提供。所有大鼠均在相同环境中适应5 d后用于实验。室温20 ℃～25 ℃，通风、光照和空气过滤系统良好，能自由摄食、摄水，且遵循《实验动物保护条例》。

1.2 材料兔抗CB2(美国Abcam 公司)，Walker-256乳腺癌细胞株( 中国上海生物医学工程研究所)，Von Frey 纤维丝(美国Stoelting 公司) 。试剂：氟代柠檬酸、水合氯醛、盐酸利多卡因注射液(均由上海复兴药业提供)。仪器：热辐射刺激仪(BME-410A)；倒置显微镜(Olympus CKX41)。

1.3 方法 40只SD大鼠注射Walker-256肿瘤细胞，建立骨癌痛模型，另取10只SD大鼠作为假手术组，10只作为对照组。首先按Hargreaves 法验证骨癌痛模型的可靠性，具体步骤如下：将大鼠置于透明有机玻璃箱内，放置于铁丝网架，使其自由活动。用100 W卤素投射灯，用辐射热刺激仪刺激的大鼠后爪，记录大鼠出现缩足逃避反应的时间，重复测量3次，每8 min 1次，取其平均值，即热缩足反射潜伏期。比较假手术组和骨癌痛大鼠热缩足反射潜伏期。再将骨癌痛大鼠随机分为FC组和非FC组，每组20只。FC组术后14 d注射氟代柠檬酸0.01 mL(1 nmol)。非FC组注射生理盐水0.01 mL，观察2组大鼠注射前、注射后1、2、4、8、12、24 h记录大鼠机械缩足阈值。

本研究采用Von Frey纤维丝测定机械缩足阈值，将大鼠置于透明有机玻璃箱内，放置于铁丝网架，大鼠在其中可以自由活动。大鼠安静后，以不同折力的Von Frey纤维丝刺激大鼠足底中后部，约持续6～8 s。再从0.20 g开始，按照递增的顺序依次施加Von Frey纤毛，直至大鼠出现缩爪。每只大鼠测定3次，每8 min测定1次，取其平均值。采用免疫印迹法测定CB2表达结果，观察灰度值。

1.3.1 骨癌痛模型建立：大鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，直至角膜反射消失，且脚趾对有齿镊钳夹无反应。于大鼠背部L3-4脊髓处剪毛、消毒，作1 cm纵向切口，分离肌肉，挑破韧带，暴露胫骨。用5 mL一次性注射针头在胫骨处穿孔，直至提示进入髓腔。给药时，将大鼠躯干固定，以5 μL一次性注射针头缓慢向髓鞘注射5 μL肿瘤细胞。最后用生物胶水封孔，逐层缝合。假手术组大鼠不注射肿瘤细胞，换以等量Hanks液，其他同骨癌痛组。

1.3.2 免疫印迹法检测CB2表达：采用Western blot 法测定脊髓CB2 的表达水平。大鼠断头处死，快速将其脊髓L3-4段取出并冷冻保存。取少量组织经裂解、超声、离心得总胞膜蛋白。以BCA法测定蛋白总量。加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗(1:500)，室温震荡孵育2 h，加入显色剂(NBT/BCIP)曝光，以灰度扫描仪测条带的灰度值。本研究中与注射FC后7、14、21 d时测定FC组和非FC组大鼠的CB2条带灰度值。

2 结果

2.1 假手术组与骨癌痛组大鼠热缩足反射潜伏期(TWL)比较 骨癌痛组大鼠TWL先缩短后恢复正常，从第3天左右缩短，显著低于假手术组和基础值(P< 0.05)，第7天基本恢复。而假手术组TWL与基础值比较，差异均无统计学意义。表明此骨癌痛大鼠模型可信可靠。见表1。

表1 假手术组与骨癌痛组大鼠热缩足反射潜伏期比较±s，s)Tab.1 Comparison of TWL between sham group and bone cancer pain ±s，s)

#P<0.05，与同期假手术组相比，compared with sham operation group

2.2 氟代柠檬酸对机械缩足反射阈值(PWMT)比较 FC组大鼠注射氟代柠檬酸后，PWMT值逐渐升高，至8 h时开始下降，最后恢复至基础值，表明氟代柠檬酸可提高大鼠疼痛阈值。详见表2。

表2 氟代柠檬酸对大鼠PWMT的影响Tab.2 Effect of fluorocitrate on rats ±s，g)

##P<0.01,#P<0.05，与非FC组相比，compared with non FC group

2.3 CB2表达情况 大鼠CB2表达基础值为(0.22±0.02)。假手术组和骨癌痛组大鼠7、14、21 d时CB2值明显高于基础值。非FC组大鼠CB2灰度值逐渐降低，第7天和第14天时显著高于假手术组，说明骨癌痛大鼠体内CB2表达增加。FC组大鼠与非FC组相比，CB2值在7 d时差异有统计学意义(P< 0.05)， 14 d和21 d时略低，但差异无统计学意义。表明注射氟代柠檬酸后CB2表达减少，但随着时间延长，又趋于一致。

表3 各组大鼠CB2表达情况Tab.

*P<0.05，与对照组相比，compared with control group；#P<0.05，与同期非FC组相比，compared with non FC group

3 讨论

骨癌痛发生机制比较复杂，可能与炎性痛和神经病理性痛有关[2-3]。早期由于肿瘤细胞在骨髓腔内生长，刺激破骨细胞，引起骨溶解和骨形成的失衡，产生明显的骨质破坏，引起疼痛；炎症和神经病理因素在肿瘤发展的后期发挥作用。氟代柠檬酸(fluorocitrate,FC)是一种特异性胶质细胞抑制剂，FC通过抑制顺乌头酸酶，并影响柠檬酸在线粒体中的转运，以干扰胶质细胞的代谢。有文献[4]报道发现大鼠鞘内注射选择性胶质细胞代谢抑制剂(FC)可减轻足底注射酵母多糖引起的热和机械痛觉过敏。而大麻素受体CB2主要表达于肥大的小胶质细胞和星形胶质细胞，可通过胶质细胞参与骨癌痛的痛觉过敏的产生和维持。在被一些活性神经活性物质激活后，胶质细胞通过调控神经活性物质的摄取间接影响神经元的生物活性，活化后还可作为免疫细胞，合成和释放多种致炎性细胞因子产生致痛作用[7-9]。脊髓鞘内注射氟代柠檬酸可以阻断一侧坐骨神经炎性痛诱致的动物的镜像痛行为反应[10-13]。但说明氟代柠檬酸可通过干扰胶质细胞的代谢而抑制CB2的表达，因此，注射氟代柠檬酸后，骨癌痛大鼠体内CB2表达减少，产生镇痛作用。

本文中，表1显示骨癌痛组大鼠TWL先缩短后恢复正常，从第3天左右缩短，显著低于假手术组和基础值(P< 0.05)，第7天基本恢复。而假手术组TWL与基础值比较，差异均无统计学意义。表明此骨癌痛大鼠模型可信可靠，这是后续实验的前提。表2说明FC组大鼠注射氟代柠檬酸后，PWMT值逐渐升高，至8 h时开始下降，最后恢复至基础值，表明氟代柠檬酸可提高大鼠疼痛阈值。而CB2与骨癌痛疼痛机制有关，因此可推测氟代柠檬酸可影响CB2的表达。表3显示，假手术组和骨癌痛组大鼠7、14、21 d时CB2灰度值明显高于基础值；非FC组大鼠CB2灰度值逐渐降低，第7天和第14天时显著高于假手术组，说明大鼠患骨癌痛后体内CB2表达增加；FC组大鼠与非FC组相比，CB2灰度值在7 d时显著降低，灰色条带变浅，14 d和21 d时略低，但差异无统计学意义。表明注射氟代柠檬酸后CB2表达减少，但随着时间延长，又趋于一致。上述结果显示，注射氟代柠檬酸后，CB2表达减少。

综上所述，患骨癌痛后，机体CB2表达会有一定程度增加，产生疼痛，而氟代柠檬酸可抑制CB2的表达，从而缓解疼痛。

[1] 吴永涛.大麻素CB1、CB2受体在脑组织中分布及其表达特性的研究[D].第三军医大学，2009.

[2] 周子超，姚尚龙.鞘内注射氟代柠檬酸对切口痛大鼠痛阈和脊髓TNF-α mRNA表达的影响[J].华中科技大学学报(医学版)，2010，39(4)：515-518.

[3] 彭艳，张艳兵，姚明，等.鞘内注射氟代柠檬酸对骨癌痛大鼠的镇痛作用[J].苏州大学学报(医学版)，2010，4：718-720+737+897.

[4] 任炳旭.脊髓水平mGluR3和mGluR5调控星形胶质细胞活化在小鼠骨癌痛形成中的作用及中医药干预的研究[D].南京中医药大学，2011.

[5] 张静.电针对炎性痛大鼠病灶局部皮肤组织CB2受体蛋白表达的影响[D].华中科技大学，2009.

[6] 贾济.大麻素CB2受体激动剂预处理在调节小胶质细胞活化和损伤中的作用[D].第四军医大学，2011.

[7] 张霞婧.CB2受体激动剂预处理通过影响小胶质细胞EAAT产生神经保护作用[D].第四军医大学，2012.

[8] 陈炯炯.新型大麻受体CB2选择性配体的设计、合成及构效关系研究[D].浙江大学，2013.

[9] 朱芳芸.电针预处理通过调节CB2R/EAAT2产生脑缺血耐受作用[D].第四军医大学，2013.

[10] Watkins LR,Milligan ED,Maier SF .Spinal cord glia:new players in pain[J].Pain,2001，93(3):201-205.

[11] Milligan ED,O’Connor KA,Nguyen KT, et al.Inrtathecal HIV 1 envelope glyco -protein gp120 induces enhancedpain states mediated by spinal cord proinflammatory cytokines[J].J Neurosci,2001,21(8):2808-2819.

[12] Milligan ED,Mehmert KK,Hinde JL,et al.Thermal hyperalgesia and mechanical allodynia produced by intrathecal administration of the human immunodeficiency Virus-1(HIV1) envelope glycoprotein gp120[J].Brain Res,2000,861(1):105-116.

[13] Sun S,Chen WL,Zhang YQ,et al.Disruption of glial function enhances electroacupuncture analgesia in arthritic rats[J].Exp Neuro,2006,198(2):294-302.

(编校：谭 玲)

Effect of fluorocitrate on expression of CB2 in a rat model of bone cancer pain

ZHANG Hui1,LI Bin2,ZHANG Hui3

(1.Department of Nursing, Henan Huanghuai University, Zhumadian 463000, China; 2.Department of Biological Engineering, Henan Huanghuai University, Zhumadian 463000, China; 3.Department of Urology Surgery, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China)

ObjectiveTo study effect of fluorocitrate on expression of CB2 in a rat model of bone cancer pain.MethodsThe Walker-256 tumor cells were injected into 40 rats to establish the bone cancer pain model.Another 10 SD rats were as sham operation group, and 10 rats were as control group.Compared TWL between sham operation(sham) group and bone cancer pain(BCP) group, the bone cancer pain rats were divided into FC group and non FC group, 0.01mL (1nmol) fluorocitrate were injected into FC group, while physiological saline were given to none FC group.Paw withdrawl mechanical threshold was recorded in rats.CB2 was determined by Western blot at the same time.ResultsTWL of BCP group initially decreased and then returned to normal, and sham group remained unchanged.After injection of fluorocitrate, PWMT of FC group increased.CB2 of sham group and BCP group were significantly higher than basal values(P< 0.05).For the none FC group rats, CB2 gradually decreased, which was significantly higher than that in sham group in 7 d and 14 d(P< 0.05).Morever, compared with the non FC group, CB2 of FC group were significantly less in 7 d(P< 0.05). ConclusionAfter suffering bone cancer pain, CB2 expression may increase to a certain extent, leading to the pain.Fluorocitrate can inhibit expression of CB2, thus relieve pain.

fluorocitrate; bone cancer pain; CB2

黄淮学院青年骨干教师资助计划；河南省教育厅科技攻关项目(14B180006)

张卉，女，研究生，讲师，研究方向：生物技术、分子生物学，E-mail：zghuii163@163.com。

R735.2

A

1005-1678(2015)02-0052-03