遵义地区多发性硬化患者血清BDV-CIC及抗体的检测

刘海军，邬小燕，田永攀，徐平Δ

(1.遵义医学院附属医院 神经内科，贵州 遵义 563000；2.遵义医学院附属医院 新生儿科，贵州 遵义 563000)



遵义地区多发性硬化患者血清BDV-CIC及抗体的检测

刘海军1，邬小燕2，田永攀1，徐平1Δ

(1.遵义医学院附属医院 神经内科，贵州 遵义 563000；2.遵义医学院附属医院 新生儿科，贵州 遵义 563000)

目的 探讨博尔纳病病毒(Borna disease virus, BDV)感染与遵义地区多发性硬化(multiple sclerosis，MS)患者的相关性。方法 运用新型的三联ELISA测循环免疫复合物、抗体的方法，检测7例MS患者及93例健康对照组血清中BDV特异性循环免疫复合物(circulating immune complex，CIC)及抗体。结果 7例MS中有2例CIC及抗体均为阳性，阳性率为28.57%(2/7)；93例对照组中CIC阳性7人，阳性率为7.53%(7/93)，抗体阳性5例，阳性率为5.38%(5/93)；多发性硬化组检出率高于健康对照对照组，但2组比较无统计学意义。结论 遵义地区存在着BDV的感染，BDV感染与多发性硬化不一定相关。

博尔纳病病毒；循环免疫复合物；酶联免疫吸附试验；多发性硬化

博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)感染的血清学和流行病学显示，BDV感染的宿主很广泛，可以感染多种脊椎动物，并且可能是人类某些神经疾病的诱因[1-4]。王长明[5]曾经在13例多发性硬化(multiple sclerosis，MS)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中检测BDV-p24基因片段，2例阳性。目前已经建立各种检测BDV的工具，但各实验室的研究数据报道差异较大，对于慢性持续感染的病毒来说检测比较困难，分析主要原因可能为病毒在体内低表达，抗原刺激机体产生抗体，抗体与抗原结合形成循环免疫复合物(circulating immune complex，CIC)，而CIC一旦形成则长期存在机体内，抗原抗体保持较低水平，免疫学检查则结果常出现假阴性表达，因此目前尚无方法能够早期快速、简捷、有效的诊断 BDV 感染。近年来，大多数学者均采用Western blot及PCR检测博尔纳病病毒的抗体或者基因片段[6]，但上述对实验者技术要求高，耗时长，操作繁琐，且检测结果特异性不高，因此在对疾病早期诊断及使用在临床中仍受限。而通过特异性CIC方法检测BDV可充分检测除显性感染以外的BDV的感染各个时期情况，且该法稳定、可信、敏感，是检测感染活化唯一的方法，并可监控整个感染过程。

本研究将采用三联ELISA法对MS患者BDV感染后产生的病毒特异性抗体及循环免疫复合物进行检测，目前国内尚未见报告，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取遵义市地区7例多发性硬化患者的血液(男性2例，女性5例)及体检者外周血液样本93例作为研究对象。BDV抗体和阳性(E4278)、阴性(LWJ)对照的样本(由重庆医科大学神经科学研究中心提供)，分别是抗P40的单克隆抗体Wl和抗P24的单克隆抗体Kfu2，BDV病毒液。

1.2 方法 分别采集患者外周血，离心后分离血浆备用。

1.2.1 血浆CIC的检测：采用羊抗鼠IgG包被，上样同时每个标本均做一副孔，加入AP标记的羊抗人IgG，后显色剂混匀后显色并加入终止液体终止反应。

1.2.2 抗体的检测：羊抗鼠IgG包被、洗板后加入W1、Kfu2、洗板后加入BDV病毒液、洗板后加入待检血浆样本，并设立空白对照、加入AP标记的羊抗人IgG、加入显色剂、加入终止液体终止反应。实验完毕后在415 nm时读取A值，检测标准：阴性<=0.1；临界值>0.1～0.12；弱阳性(-+)>0.12～0.15；阳性(+)>0.15～0.3；中度阳性(++)>0.3～0.6；强阳性(+++)>0.6～1.0；极强阳性(++++)>1.0。并重复检验2次。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行数据处理，计数资料用率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 血浆中BDV CIC及抗体的ELISA检测结果

7例MS患者中有2例患者 CIC呈阳性，2例患者抗体呈阳性，2例患者CIC及抗体均为阳性；而对照组中共有7例患者 CIC呈阳性，5例患者抗体呈阳性，2项指标均为阳性患者共5例。MS组BDV-CIC阳性和BDV抗体阳性检出率分别为28.57%和28.57%，双阳性率为100%。而对照组BDV-CIC阳性和BDV抗体阳性检出率分别为7.53%和5.38%，双阳性率为71.4%。MS组的双阳性率略高于对照组，2者相比，差异无统计学意义。见表1。

表1 多发性硬化组与健康对照组血浆中BDV-CIC及BDV抗体检出率(%)Tab.1 Multiple sclerosis patients and healthy controls plasma BDV-CIC and BDV antibody detection rate(%)

3 讨论

MS是一种由病毒、遗传及环境等多种原因诱发的病变主要累及中枢神经系统(central nervous system，CNS)白质的与免疫介导相关的CNS炎性脱髓鞘性疾病。MS在临床上多以广泛脱髓鞘病变及少突胶质细胞受损为主要表现。目前关于MS的发病机制尚在探讨中，曾经高度怀疑与一些病毒有关，如EB病毒、麻疹病毒等，但均未从脑组织分离到病毒。研究发现，当病毒感染人体后，其可能存在与少突胶质细胞或CNS髓鞘蛋白共同的抗原，导致T细胞激活，形成病毒抗体并与神经髓鞘多肽片段交联诱发脱髓鞘病变[7-8]。研究表明，多个亚型的T细胞在MS的发病过程及调控中发挥重要作用。其中包括CD4+Th1细胞、CD8+T细胞、Th2细胞、Th17细胞、NK T细胞、CD16+γδ T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞等[9]。Viglietta[10]研究发现，复发-缓解型多发性硬化(RRMS)患者的CD4+CD25调节性T细胞(Treg)数量与健康对照组相比，2者无差异，但功能却明显下降，因此认为这可能为MS致病因素之一。德国Haas[11]证实上述论述，但进一步指出Treg在脑脊液中CD4+T占有的比例与外周血之间比较无明显统计学差异，故而认为外周血Treg功能降低与Treg进入CNS发挥免疫抑制功能无关。在MS缓解期Treg依然是降低的，故推论MS患者Treg功能降低与该病是否活动无关。CD8+T对于多发性硬化的致病也逐渐被认识到，作为抗原识别的结果，CD8+T细胞可诱导少突胶质细胞体内溶解，还可调控多发性硬化患者中枢神经系统的免疫反应而参与疾病的发展。同时，Malmeström等[12]还在研究中指出，CSF/CNS中可能存在CD8+T细胞介导的细胞毒作用并具有一定的特异性，这种特异性作用可能与RRMS病人复发有关并可能对恢复期病人产生持续几个月的损害。

BDV可引起中枢神经系统持续感染并导致博尔纳病(BD)，即免疫介导的脑脊髓炎[13]。浸润的免疫细胞以CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞和B细胞为特征。CD8+T细胞代表对核蛋白呈抗原特异性的效应细胞群[14]。Richt[15]将纯化的BDV特异性抗原NP免疫大鼠，从其淋巴结获取淋巴细胞，用于体外培养和接受再刺激，BDV接种大鼠后发现在灰质、白质出现了免疫介导的血管炎性反应。分析这些细胞系揭示了BDV的特异性、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)II类抗原的限制性、以及CD4+辅助/炎症细胞的表型标志。Planz[16]用这些细胞系被动转移到BDV感染的环磷酰胺免疫抑制的大鼠，在注射后5 d可致共济失调、麻痹等神经症状，14～16 d出现典型BD表现；被动转移到非感染大鼠不引起脑炎或疾病，表明该BDV特异性T细胞系自身并不致脑炎。免疫组织学分析发现有BD症状大鼠一致表现脑炎病变中有CD8+T细胞，CD4+T细胞均存在于病毒特异性CD4+T细胞系感染的大鼠脑中，这一点与是否有神经症状无关。然而，用抗CD8+T细胞抗体处理的大鼠受者既不发生脑炎也无疾病症状。因此，CD4+T细胞在脑中积聚引起了血管周炎症损害，但很明显单独并不致病。而CD8+T细胞的出现显然与神经症状发生直接相关。Bilzer[17]进一步指出，在BDV感染的实验大鼠的脑实质的神经元内检测到CD8+T细胞、MHC I类抗原的表达。用单克隆抗体OX-8治疗BDV感染的大鼠，发现它抑制CD8+细胞免疫病理反应和降低的MHC I类抗原的表达。结果显示CD8+T细胞在脑实质内的存在和神经元的MHC I类抗原对脑组织的免疫病理破坏和T细胞介导的细胞毒作用可以破坏BDV病毒对体内神经元的损伤。另外BDV感染大鼠脑组织分析发现不同的细胞因子mRNA包括IL-6、TNF-α、IL-1、INF-γ、IL-2、 IL-4和IL-10水平增高。这些细胞因子mRNA在炎症反应高峰达最高水平，疾病慢性期明显下降。Stitz[18]也证实BDV特异性的CD8+T细胞是效应细胞群体的代表。。

BDV感染体内可在CNS引起T细胞介导的免疫病理反应。MS致病过程为细胞免疫、体液免疫反应、细胞因子(Th1、Th2、Th17)等作用，从T细胞介导的免疫反应来分析2者有研究共同基础。分子模拟学说中病毒为了躲避宿主机体的复杂的防御体系，病毒基因组可以通过编码一些蛋白质分子, 模拟细胞内信号转导的构成元件或直接充当信号过程中所需成分的封闭因子, 进行对宿主细胞内的信号转导系统进行干预和调节。研究发现, 在BDV感染过程中BDV 蛋白可以通过分子模拟机制与机体相关蛋白(如高迁移率族蛋白、细胞周期蛋白以及热休克蛋白等)结合，而参与BDV的感染与致病过程[19]。目前关于BDV是否与少突胶质细胞或CNS髓鞘蛋白存在共同抗原及在受感染机体内T细胞激活并生成病毒抗体与神经髓鞘多肽片段发生交叉反应而导致脱髓鞘病变，尚未见报道。

本次研究的7例MS患者的临床资料显示为6例为复发-缓解型，1例为原发进展型，其中7例MS患者中有2例患者 CIC呈阳性，2例患者抗体呈阳性，2例患者CIC及抗体均为阳性；而对照组中共有7例患者 CIC呈阳性，5例患者抗体呈阳性，2项指标均为阳性患者共5例。MS组BDV-CIC阳性和BDV抗体阳性检出率分别为28.57%和28.57%，双阳性率为100%。而对照组BDV-CIC阳性和BDV抗体阳性检出率分别为7.53%和5.38%，双阳性率为71.4%。说明贵州省部分地区MS患者中存在 BDV感染。这一阳性率报道与本课题组王长明前期报道的15.38%(2/13)[5]，相差较大，这可能为2次样本量均较少有关，郭霞[20]曾经报道在6例MS患者CSF中检测到2例患者的脑脊液中CIC为阳性，阳性率33.33%(2/6)相接近，同样系样本量较少所致。本研究中的2例检测阳性的MS患者均不同程度存在精神异常，其中1例来自农村(凤冈县)，无密切的动物接触史，主要表现为渐进性肢体抖动、无力、言语不清、吞咽困难及强哭强笑，并有癫痫发作，而另1例患者同样有精神异常，主要为神志淡漠、懒言少语。BDV感染后产生的精神异常目前主要在动物模型上被研究证实。Pletnikov[21]通过BDV感染大鼠后证实海马、齿状回颗粒细胞的持续退行性变，BDV的新发感染也显示出与皮层的细化有关，这些结构与精神行为异常均有明显关联。值得一提的是，即使检测到抗体也不能证明BDV正处于感染中，因为有可能患者已经进入了恢复期或者处于病毒携带状态[22]。Bode[2]曾提出对于CIC 阳性的病人，需检测其抗原、抗体，如抗原阳性提示急性期感染，应给予抗病毒治疗，如抗体阳性或者阴性也应该进行相关治疗。本次样本量分析由于本研究病例较少，又无流行病学资料，检测的2例患者的精神异常及与BDV感染后的精神异常是否有关联，抗病毒治疗措施是否适用，需要在今后研究中扩大样本量，收集更多的临床资料进一步研究后证实。

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(编校：王冬梅)

Detection of the BDV specific CIC in plasma of patients with multiple sclerosis of Zunyi regions

LIU Hai-jun1, WU Xiao-yan2, TIAN Yong-pan1, XU Ping1Δ

(1.Department of Neurology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563000, China; 2.Department of Neonatology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China)

ObjectiveTo study the correlation with the infectious situation of Borna disease with the multiple sclerosisof Zunyi region.MethodsEstablished method of the specific CIC and an antibody of Borna were used to detect the PBMC of 7cases of patients with multiple sclerosis and 93 cases of control group.ResultsIn the collected 7 cases of PBMC in patients with multiple sclerosis, detected 2 positive samples of the specific CIC and antibody of Borna with a positive rate of 28.57%(2/7). Meanwhile, positive plasma samples were also detected in healthy control group, and the positive rate was 7.53%(7/93),The antibody positive rate of control group was also 5.38%(5/93). But between the two groups, the difference was no statistically significant.ConclusionResults indicate that the possibility of BDV infection is presented in Zunyi regions.BDV infection is not necessarily associated with multiple sclerosis.

BDV; CIC; ELISA; multiple sclerosis

国家自然科学基金(31160210)；贵州省科学技术基金(黔科合J字LKZ[2011]13号)

刘海军，男，硕士，主治医师，研究方向：中枢神经系统感染，E-mail：63258787@qq.com;徐平，通讯作者，男，博士，主任医师，研究方向：中枢神经系统感染，E-mail：xuping527@vip.sina.com。

R751

A

1005-1678(2015)09-0064-03