人参皂苷纳米乳的美白抗衰作用及其安全性评价

贾越光，丁志英，肖嘉婧 ，张新然，3， 池季洪 ，孙波Δ

(1.一汽总医院 药学部，吉林 长春 130011；2.吉林大学 药学院，吉林 长春 130021；3.北京大学医学部 药学院，北京 100191)



人参皂苷纳米乳的美白抗衰作用及其安全性评价

贾越光1，丁志英2†，肖嘉婧2，张新然2，3， 池季洪2，孙波2Δ

(1.一汽总医院 药学部，吉林 长春 130011；2.吉林大学 药学院，吉林 长春 130021；3.北京大学医学部 药学院，北京 100191)

目的 研究人参皂苷纳米乳的美白抗衰作用及其安全性。方法 美白作用: 用维生素C为对照药品，测定酪氨酸酶抑制率。抗衰老作用：建立D-半乳糖大鼠衰老模型，在大鼠颈背部皮肤上涂抹人参皂苷纳米乳及对照药品，每日2次，制备涂片，比较皮肤组织纤维的排列变化，测定DPPH自由基清除率。安全性评价：观察皮肤涂抹人参皂苷纳米乳及对照药品后，不同时间的皮肤变化情况。结果 人参皂苷浓度为7.00 mg/mL时，酪氨酸酶抑制率顺序是，维生素C水溶液>人参皂苷纳米乳>人参皂苷水溶液；在衰老大鼠皮肤上涂抹人参皂苷纳米乳，切片结果显示，弹力纤维与皮肤表面较为平行，而未涂抹的对照组，弹力纤维排列较为曲折，与皮肤表面不平行；DPPH自由基清除率结果显示， 维生素C水溶液>人参皂苷纳米乳>人参皂苷水溶液，且随着人参皂苷载药量的增大，人参皂苷纳米乳清除DPPH自由基的效率明显上升；安全性结果显示，皮肤涂抹人参皂苷纳米乳后，没有红肿、刺激等现象发生。结论 人参皂苷纳米乳比人参皂苷水溶液具有更明显的美白抗衰作用，没有刺激，不会对皮肤造成损伤，安全可靠。

人参皂苷；纳米乳；抗衰老；美白；安全性

传统中药人参Ginseng Radix et Rhizoma 系五加科人参属植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎，“味甘，微寒，主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智，久服轻身延年”[1]。始载于我国历史上第一部记载药物的著作《神农本草经》，列为上品。

人参的特征性化学成分主要为人参皂苷(ginsenoside)[2-3]，具有改善记忆障碍、延缓衰老、提高免疫功能、抗氧化、 改善心血管系统功能、抗应激、壮阳等作用，一直是国内外医药领域的研究热点[3-6]。人参皂苷既可抑制自由基的产生， 也可直接对抗自由基对组织及细胞的损伤作用， 或直接清除自由基， 还可增强机体本身抗氧化系统的功能，从多个环节阻断自由基的损伤作用[7]。人参通过提高体内及皮肤表皮细胞内超氧化物歧化酶的活性，来加强活性氧化自由基的消除，阻止体内有害物质的产生，改善机体的代谢，减少或消除已经产生并积滞于体内的脂褐质[5]。人参还具有抗紫外线护肤的功能。其中人参皂苷是一种生理活性物质，具有护肤、抗紫外线功能。是高档化妆品的天然添加物，对妇女雀斑、褐斑、蝴蝶斑及老年皮肤色素沉着疗效显著[8-9]。

纳米乳是指由油、水、乳化剂和助乳化剂形成的粒径小于100 nm，外观澄清透明的热力学稳定体系。经皮给药具有避免引发胃肠道刺激、肝脏首过效应及患者可接受性强等特点，纳米乳由水相、油相、表面活性剂(S)和助表面活性剂(COS)四种成份组成，除了具有稳定性好、制备简单、粒径小(仅为10～100 nm)等优点外，相关研究显示纳米乳具有独特的经皮机理和特性，纳米乳的表观透皮系数Kp值分别是凝胶的2.4 倍及酊剂的3.2 倍[10]。纳米乳具有透皮促进渗透作用，可增加药物的透皮吸收量[11]。研制人参皂苷纳米乳，研究其对皮肤的美白抗衰作用和安全性，为人参皂苷纳米乳经皮吸收的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：Wistar大鼠30只(吉林大学实验动物中心，SCKK-(吉)-2007-0003)，平均体重(120g±5)g。

1.1.3 主要仪器：HJ-6A多头磁力加热搅拌器(常州国华电器有限公司)；BSA124S电子天平(德国sartorius科学仪器有限公司)；Nano-ZS粒度测定仪(马尔文公司)；WFV UV-2100紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂)；RM2245切片机(Leica)；BMJ-1生物组织包埋机(天津航空机电公司)；202-OA型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配置：酪氨酸酶溶液：称取500 U/mg的酪氨酸酶，用PBS溶液配制成100 U/mg的酶液，冷冻保存。

L-酪氨酸溶液：称取L-酪氨酸与PBS缓冲液配制成0.05%的溶液。

人参皂苷纳米乳：取处方量的大豆卵磷脂、Labrasal、1，2-丙二醇和IPM混匀，搅拌下缓慢滴加蒸馏水，再加入处方量的人参皂苷，搅拌至溶解[12]，得澄清透明淡黄色人参皂苷纳米乳，测定粒径和电位，鉴定纳米乳的类型。

人参皂苷水溶液：将人参皂苷加入蒸馏水中，搅拌直至溶解，载药量与人参皂苷纳米乳相同。

VC溶液：将VC溶于蒸馏水中，制成与纳米乳载药量相等的溶液。

D-半乳糖溶液：取D-半乳糖用生理盐水，配置成1 g/100 mL浓度的D-半乳糖溶液。

政策四：7月4日，国家市场监管总局、农业农村部、国家卫生健康委员会三部门联合发布《关于加强食用植物油标识管理的公告》，明确提出转基因食用植物油应当按照规定在标签、说明书上显著标示。对我国未批准进口用作加工原料且未批准在国内商业化种植，市场上并不存在该种转基因作物及其加工品的，食用植物油标签、说明书不得标注“非转基因”字样。

DPPH自由基溶液：量取DPPH，用无水乙醇配置成浓度为0.04 g/L的溶液，冷藏。

1.2.2 酪氨酸酶抑制试验:按表1配制好反应组T1、T2、C1、C2置于EP管中，混合均匀，置37 ℃恒温水浴锅内，保持反应10 min，向各个管中加入L-酪氨酸溶液1 mL，混合均匀，再置于37 ℃恒温水浴锅内，保持反应4分钟，迅速放入比色皿中，于第5分钟在475 nm处测得吸光度AT1、AT2、AC1、AC2，根据抑制率公式，计算人参皂苷纳米乳、空白纳米乳、人参皂苷水溶液、VC溶液作为供试药液，对酪氨酸酶的抑制率[13]。

抑制率表1 酪氨酸酶抑制实验试剂配比表Tab.1 Tyrosinase inhibition test kit

1.2.3 大鼠抗衰老实验:将30只大鼠随机分为6组，剔去背部皮肤的毛，在颈背部取2 cm×2 cm的部位剃毛，每天早晚各涂抹一次实验药品，每次0.5 mL。①组涂抹人参皂苷纳米乳，注射D-半乳和糖溶液；②组涂抹人参皂苷纳米乳，注射生理盐水；③组涂抹人参皂苷水溶液，注射D-半乳糖溶液；④组涂抹人参皂苷水溶液，注射生理盐水；⑤组涂抹空白纳米乳，注射D-半乳糖溶液；⑥组涂抹空白纳米乳，注射生理盐水。①③⑤每天注射一次配置好的1%的D-半乳糖溶液50 mg/kg，约0.5 mL。②④⑥每天注射一次等量的生理盐水。涂抹1 h、24 h和48 h及20天观察皮肤涂抹部位反应和变化。

1.2.4 切片制备及染色:处死大鼠，取涂抹药物的实验组皮肤和未涂抹药物的对照组相同位置皮肤，按以下步骤制备切片和染色：① 10%的甲醛溶液固定；②用水冲洗；③用不同浓度的酒精脱水；④用无水乙醇和二甲苯使切片透明；⑤用石蜡进行进蜡和包埋；⑥切片；⑦展开；⑧烘干；⑨用苏木精、伊红、二甲苯、无水乙醇等进行染色；⑩用树胶封片[14]。之后在显微镜下观察弹力纤维和胶原纤维的排列情况。

1.2.5 DPPH自由基清除试验:首先将制备的人参皂苷纳米乳以及相同载药量的人参皂苷水溶液和VC溶液进行稀释，浓度分布为1.80 mg/mL、3.57 mg/mL、7.00 mg/mL、13.48 mg/mL作为对照组。

取DPPH自由基溶液和乙醇各2 ml置于同一EP管中，混合均匀避光放置30 min，于517 nm测得吸光度Ac；另称取DPPH自由基溶液和人参皂苷纳米乳各2 mL置于同一EP管中，混合均匀避光放置30 min，于517 nm测得吸光度Ai；称取乙醇溶液和人参皂苷纳米乳各2 mL置于同一EP管中，混合均匀避光放置30 min，于517 nm测得吸光度Aj[15]。平行测三组数据，根据以下公式计算人参皂苷纳米乳、人参皂苷水溶液和空白纳米乳对DPPH自由基的清除率。

2 结果

2.1 人参皂苷纳米乳的粒径、zeta电位及结构类型 人参皂苷纳米乳(载药量为3.5%)平均粒径39.53，分布范围窄，粒径较均匀，PdI为0.789。见图1。

图1 人参皂苷纳米乳粒径Fig.1 The size of ginseng saponins nano

人参皂苷纳米乳的zeta电位为-0.368 mV。见图2。

图2 人参皂苷纳米乳zeta电位Fig.2 The zeta electric potential of ginseng saponins nano

纳米乳中滴加了水溶性染料亚甲蓝后，迅速扩散，表明人参皂苷纳米乳为水包油(O/W)型。见图3。纳米乳中滴加了脂溶性染料苏丹红Ⅲ后，不扩散，表明人参皂苷纳米乳为水包油(O/W)型。见图4。

图3 亚甲蓝染色Fig.3 Methylene blue staining

图4 苏丹红Ⅲ染色Fig.4 Tonyred Ⅲstaining

2.2 酪氨酸酶抑制试验 人参皂苷纳米乳及对照品的酪氨酸酶抑制率，在人参皂苷浓度为7.00 mg/mL时，抑制率顺序为：维生素C>人参皂苷纳米乳>人参皂苷水溶液；而在实验的其它浓度时，抑制率顺序为：维生素C>人参皂苷水溶液>人参皂苷纳米乳；表明人参皂苷纳米乳的美白作用与浓度密切相关。见表2。

表2 不同药物对酪氨酸酶的抑制率Tab.2 Inhibitory rate of different drugs on tyrosinase

人参皂苷纳米乳的酪氨酸酶抑制率曲线，结果显示，抑制率随人参皂苷浓度不同而改变，其中，人参皂苷浓度为7.00 mg/mL时，抑制率达到最大值64%，远高于人参皂苷水溶液9%。见图5。

图5 人参皂苷纳米乳酪氨酸酶抑制率结果Fig.5 Inhibition rate ginsenoside nanometer cheese

2.3 皮肤切片中纤维排列变化 涂抹人参皂苷纳米乳(载药量约为3.5%)后，皮肤弹力纤维和胶原纤维排列规则，而且与皮肤表面较为平行，表明人参皂苷纳米乳具有抗皮肤衰老作用；而对照组的弹力纤维和胶原纤维排列紊乱，纤维走向不再平行于表皮，不利于承受来自外界的张力，表现出皮肤衰老状态。见图6、7。

图6 涂抹人参皂苷纳米乳组(HE染色法×400)Fig.6 experimental group(HE staining×400)

图7 对照组(HE染色法×400)Fig.7 matched group(HE staining×400)

2.4 自由基清除试验 DPPH自由基清除实验结果见图8和图9及表3所示。其中图8表明，人参皂苷纳米乳对DPPH自由基的清除效果要优于人参皂苷水溶液，但不如VC水溶液，说明人参皂苷纳米乳具有明显的抗衰老作用。

图8 DPPH自由基清除率结果(未稀释)Fig.8 DPPH free radicalscavenging rate(no dilute)

图9表明，人参皂苷纳米乳随着浓度的增加，清除自由基的能力增强，当浓度达到13.48 mg/mL时，人参皂苷纳米乳的自由基清除能力与阳性对照VC水溶液相当。实验中，还对比了人参皂苷水溶液，结果没有规律，有待继续深入研究。

图9 DPPH自由基清除率结果Fig.9 DPPH free radicalscavenging rate

浓度(mg/mL)纳米乳水溶液维生素C3.5%(182)88.7358.5994.491.833.45—95.923.5736.10—73.627.0050.44—93.9813.4880.00—80.88

2.5 皮肤安全性评价 皮肤涂抹人参皂苷纳米乳后，不同时间观察皮肤均没有任何红斑、水肿、溃疡或出血等变化，表明人参皂苷纳米乳对皮肤没有刺激性和损伤。

3 讨论

人参皂苷纳米乳具有美白和抗衰老作用，在浓度为7.00 mg/mL时，人参皂苷纳米乳比人参皂苷水溶液作用更强，且对无皮肤刺性和损伤，安全可靠。

预实验测得较高浓度的人参皂苷纳米乳和极低浓度的人参皂苷纳米乳对酪氨酸酶没有抑制作用。因此，选用浓度分别为1.80 mg/mL、3.57 mg/mL、7.00 mg/mL、13.48 mg/mL的人参皂苷纳米乳以及相同浓度的人参皂苷水溶液和维生素C水溶液进行实验研究，结果在浓度为7.00 mg/mL时，人参皂苷纳米乳比人参皂苷水溶液作用更强。文献[16]研究认为人参皂苷Rb1 浓度<50 μg/mL对黑色素细胞的生长增殖没有影响。文献[17]研究表明，Rb1 在小剂量时B16黑色素细胞增殖有促进作用， 大剂量时对B16黑色素细胞增殖有抑制作用，而对体外酪氨酸酶活性无影响，这些结果与本实验研究结果相同，说明人参皂苷的美白功效并不是用量越多越好，且本实验研制的人参皂苷纳米乳载药量也在文献报道的美白浓度范围内一致。实验结果中人参皂苷纳米乳也是能改变皮肤中弹力纤维胶原纤维，发挥抗衰老作用与人参皂苷通过提高抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力，增加皮肤中弹力纤维胶原纤维含量，抑制人角质形成细胞凋亡，最终发挥抗皮肤衰老作用[15]的结论一致。

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(编校：谭玲)

Whitening and anti-aging effect of ginseng saponin nano and its safety evaluation

JIA Yue-guang1, DING Zhi-ying2†, XIAO Jia-jing2, ZHANG Xin-ran2,3, CHI Ji-hong2, SUN Bo2Δ

(1.Department of Pharmacy, General Hospital, Fourth Hospital of Jilin University, Changchun 130011, China; 2.School of Pharmacy, Jilin University, Changchun 130021, China; 3.School of Pharmacy, Peking University Health Science Center, Beijing 100191, China)

ObjectiveTo study on whitening and anti - aging effect of ginseng saponin and its safety.MethodsWhitening effect: using vitamin C as the control drug, the inhibition rate of tyrosinase was determined.Anti senescence effect: the aging model of D- was established, and the DPPH was applied to the skin of the rat's neck, and the drug was prepared by 2 times a day.Skin safety evaluation: the skin changes of the skin of the ginseng saponins were observed after the skin was given ginseng saponin and control drugs.ResultsWhen the concentration of ginsenoside was 7 mg/mL, the inhibition rate order was, the water solution of vitamin C>ginsenoside nano >ginsenoside aqueous solution ; In the aging model, the surface of the elastic fibers and the skin surface was parallel to the skin, but the elastic fibers were arranged in a more tortuous and non parallel to the skin; DPPH free radical scavenging effect order was, Vitamin C aqueous solution>ginsenoside nano>ginsenoside aqueous solution, and with the dosage of ginsenoside increasing, the efficiency of ginsenoside DPPH scavenging free radical increased significantly; Skin safety evaluation results showed that ginseng saponin nanometer milk smeared skin, no redness, irritation and other phenomena occured.ConclusionGinseng saponin nanometer milk has obvious whitening effect, and can not cause damage to the skin, is safe and reliable.

ginsenoside; nano emulsion; anti-aging;whitening; security

吉林省科技发展计划项目(20110919)

贾越光，女，本科，副主任药师，研究方向：新药研究，E-mail： yqzyyjyg@.163.com；丁志英，共同第一作者，女，博士，博士生导师，研究方向：纳米载药系统经皮吸收研究，生物药剂学与药物动力学研究，临床药学研究，E-mail：dzy@jlu.edu.cn；孙波，男，通讯作者，本科，高级工程师，研究方向：实验病理学，E-mail： zbr@jlu.edu.cn。

R283

A

1005-1678(2015)09-0019-04