732型阳离子树脂分离纯化吴茱萸总碱及抗乳腺癌研究

陈仕学，姚元勇，卢忠英，唐帮成

(铜仁学院 材料与化学工程学院 梵净山特色动植物资源重点实验室，贵州 铜仁 554300)



732型阳离子树脂分离纯化吴茱萸总碱及抗乳腺癌研究

陈仕学，姚元勇，卢忠英，唐帮成Δ

(铜仁学院 材料与化学工程学院 梵净山特色动植物资源重点实验室，贵州 铜仁 554300)

目的 研究吴茱萸总碱最佳纯化工艺路线及其抗乳腺癌活性。方法 分别采用传统提取纯化和732型阳离子交换树脂法提取纯化吴茱萸总碱，用碘化汞钾试剂对其进行定性分析，并对洗脱剂进行选择。应用MTT实验对所提取的吴茱萸总碱进行抗乳腺癌活性测试。结果 与传统提取工艺相比，732型阳离子交换树脂法提取吴茱萸总碱的产率较高(16.18%)；732型阳离子树脂纯化法提取吴茱萸总碱的最佳洗脱剂为饱和氯化钠溶液；细胞毒性实验结果表明U251乳腺癌细胞对吴茱萸总碱的浓度依赖性不强，即随着载药浓度的增加，细胞的形态改变不大、凋亡的细胞数量增多不明显。当浓度为50 μmol/mL，作用时间为24 h时，细胞的存活率为68%；随着浓度的增加(100、150 μmol/mL)，作用时间为24 h时，细胞的存活率分别为66%和60%。结论 与传统提取法相比，732型阳离子树脂纯化法提取的吴茱萸总碱纯度较高；同时吴茱萸总碱对乳腺癌细胞具有明显的抑制作用。

吴茱萸；阳离子交换树脂；纯化工艺；总碱

吴茱萸(Evodiarutaecarpa)为芸香科植物，药用部位为干燥近成熟的果实，其果实除具有温祛寒、散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效外，对于呕吐泄泻、头痛眩晕也具有一定的生物活性[1]。吴茱萸主要含有挥发油、生物碱、苦味素等多种化学成分[2-5]，以生物碱居多，而生物碱中最主要的有效成分为吴茱萸碱和吴茱萸次碱[6-7]，结构见图1。张莹等[8]采用吴茱萸碱诱导小鼠纤维肉瘤L929细胞凋亡过程中对细胞周期的阻滞作用。

图1 吴茱萸碱(a)、吴茱萸次碱(b)结构式Fig.1 Structure of evodiamine (a) and rutaecarpin (b)

目前，生物碱的提取工艺报道较多，但其在植物药材中的相对含量较低，提取纯化工艺研究仍然较困难[9]。生物碱提取纯化方法常用离子树脂交换法、有机溶剂萃取法和大孔吸附树脂法。离子交换反应实现物质分离的离子树脂交换法，是利用离子树脂作为的固定相与目标提取物的结合能力强弱，流动相则可除去多余杂质，其有洗脱效果好，提取效率高的优点；有机溶剂提取法缺点表现为提取效率低、纯度不高、提取时间较长；大孔吸附树脂法在用于生物碱的提取纯化时，也存在吸附困难、造价高等问题。

本文采用离子交换树脂法中的732型阳离子树脂纯化法对吴茱萸生物碱进行纯化[10]，其原理是：以732型阳离子交换树脂作为固定相，可溶解吴茱萸生物碱中多余杂质的水或含有水的溶剂作为流动相，当流动相流过732型阳离子交换柱时，生物碱中能与树脂上的交换基团发生离子交换的物质就能被吸附到阳离子交换柱上，利用流动相除去杂质，最后选择适当的洗脱剂洗脱生物碱，即实现了物质的分离[11-12]，为中医药研究，提供了一定参考价值。

1 材料与方法

1.1.1 药材：吴茱萸(Evodiarutaecarpa)购于铜仁市中药材市场，由铜仁学院中药学专业鲁道旺副教授鉴定，于60 ℃的烘箱中烘干，粉碎，过60目筛，室温保存备用。

1.1.2 药品与试剂：吴茱萸碱(批号：E101966)、吴茱萸次碱(批号：R107338)均购于阿拉丁试剂公司。732型阳离子树脂(武汉华众新化工有限公司)；碘化汞钾(化学醇，阿拉丁公司)；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器：RE-2000A旋转蒸发仪(上海豫康科教仪器公司)；98-Ⅱ-B电子天平(天津泰斯特仪器有限公司)；ZF-Ⅰ紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 传统提取纯化法：称取吴茱萸药材粉末50 g，加入5%HCl溶液 100 mL，于35 ℃水浴下浸泡6 h。用5%NaOH调节pH至9～10，静置，抽滤，得到滤渣。将滤渣用150 mL乙醇浸泡6 h，抽滤，得乙醇溶液。在60 ℃条件下，旋转蒸发脱去乙醇溶剂，得浸膏，再用氯仿萃取3次，无水MgSO4干燥，抽滤，萃取脱去氯仿溶剂，即得黄色沉淀物(0.5 mg/L)。见图2。

图2 传统提取纯化工艺流程Fig.2 Traditional process of extraction-purification

1.2.2 阳离子树脂的预处理：称取100 g 732型阳离子树脂，用去离子水浸泡2 h，装入层析柱中。用去离子水冲洗至无色显中性，再用2%的HCl溶液冲洗至显酸性；将显酸性阳离子树脂用去离子水冲洗至中性(pH试纸)，再用2%NaOH冲洗至显碱性(pH为8～9)；将显碱性的阳离子树脂用去离子水冲洗至中性，再用2%的HCl冲洗至显酸性，最后用去离子水冲洗至中性即可。

图3 阳离子树脂的预处理Fig.3 Preprocessing cation exchange resin

1.2.3 阳离子树脂纯化工艺流程：称取吴茱萸药材粉末50 g，加人5%HCl溶液100 mL，于35 ℃水浴下浸泡6 h，取出，用5%NaOH调节pH至9～10，静置，抽滤，得到滤渣。将滤渣用150 mL乙醇浸泡6 h，抽滤，得乙醇溶液。在60 ℃条件下，旋转蒸发脱去乙醇溶剂，得浸膏。将处理好的树脂倒入烧杯中，加入乙醇溶解的吴茱萸总碱，用玻璃棒轻轻搅拌致吴茱萸总碱充分吸附在树脂上，再将树脂装柱，用饱和氯化钠溶液洗脱，TLC追踪反应，至产物全部洗脱完毕，将洗脱溶剂调节pH至9～10，冷藏，自然沉淀，抽滤，即得黄色沉淀物。用毛细管取少量产物，乙醇溶解后调节pH至2～3。加入0.1 g碘化汞钾，产生黄色沉淀。说明该产物为吴茱萸总碱。见图4。

图4 阳离子树脂纯化工艺流程Fig.4 Process of purification by cation exchange resin

1.2.4 阳离子树脂纯化吴茱萸生物碱的洗脱剂选择：用732型阳离子交换树脂法提取吴茱萸碱，在选择洗脱剂时，分别采用浓度为5%氨水、氨水-乙醇(v/v=1/19)、10%盐酸、饱和浓度的氯化钠洗脱。用TLC追踪反应，直至吴茱萸生物碱全部洗脱完毕，取洗脱液于60 ℃条件下旋干，得吴茱萸总碱，见图5。取少量产物，乙醇溶解后调节pH为2～3。加入0.1g碘化汞钾，产生黄色沉淀。说明该产物为吴茱萸总碱。

图5 洗脱剂的选择工艺流程Fig.5 Process of elute’s selection

1.2.5 MTT检测：经阳离子树脂纯化后得到的吴茱萸总碱进行MTT检测[13]，用天平分别准确称取纯化的吴茱萸总碱和传统法得到的吴茱萸总碱0.55g，分别溶于1 mL的纯净水中，配制成为1.67 mmol/ mL的溶液。

生长状态良好U251人脑胶质瘤细胞作为对照组，常规消化，以5000个/孔的密度接种于96孔板，每孔体积为200 μL，倒置显微镜下观察细胞生长情况。吴茱萸总碱组和传统吴茱萸总碱组分别设50、100、150 μmol/mL 3个梯度，分别吸取30、60、90 μL于96孔板中，每个浓度均设定8个复孔。培养24 h后将浓度为5 mg/mL的MTT(噻唑蓝)以每孔20 μL加入待测的96孔板内，37 ℃培养4 h，弃去上清液，每孔加200 μL DMSO以溶解所产生的Formazan，振荡20 min，使结晶物充分溶解，最后用酶标仪于570 nm波长处测定各孔的吸光度(A值)，记录结果。

细胞存活率的计算：用自由生长U251细胞作为对照，求出各实验组细胞的存活率[14]：

注： A(Test)为纯化的吴茱萸总碱组或者传统法得到的吴茱萸总碱组吸光度值；A(Control)为对照组的吸光度值。

2 结果

2.1 吴茱萸总碱的鉴定 用石油醚︰乙酸乙酯=5︰1(v/v)为展开剂，将传统提取法得到的吴茱萸总碱和阳离子树脂法得到的吴茱萸总碱与吴茱萸次碱标准品作TLC对比，见图6(左)。R1为原点到层析点的距离，R2为原点到溶剂前缘的距离，Rf为比移值，Rf= R1/R2。由Rf计算公式可知：在层析点1处，传统提取法得到的吴茱萸总碱Rf值为0.126(1.45 cm/9.1 cm)；阳离子树脂提取纯化法得到的吴茱萸总碱Rf值为0.121(1.1 cm/9.1 cm)；在层析点3处，传统提取法得到的吴茱萸总碱Rf值为0.649(5.91 cm/9.1 cm)，而阳离子树脂提取纯化法得到的吴茱萸总碱和吴茱萸次碱标准品在层析点3处均不显色；在层析4处，传统提取法得到的吴茱萸总碱Rf值为0.741(6.74 cm/9.1 cm)，阳离子树脂提取纯化法得到的吴茱萸总碱Rf值为0.752(6.84 cm/9.1 cm)，且吴茱萸次碱标准品的Rf值为0.801(7.29 cm/9.1 cm)。用石油醚︰乙酸乙酯=5︰1(v/v)为展开剂，将传统提取法得到的吴茱萸总碱和阳离子树脂提取纯化法得到的吴茱萸总碱与吴茱萸碱标准品作TLC对比，见图6(右)。由图6可知：在层析点4处，传统提取法得到的吴茱萸总碱Rf值为0.743(6.76 cm/9.1 cm)，阳离子树脂提取纯化法得到的吴茱萸总碱Rf值为0.751(6.83 cm/9.1 cm)；在层析点3处，传统提取法得到的吴茱萸总碱Rf值为0.652(5.93 cm/9.1 cm)，而阳离子树脂提取纯化法得到的吴茱萸总碱和吴茱萸次碱标准品在此处均不显色。在层析点2处，传统提取法得到的吴茱萸总碱Rf值为0.415(3.78 cm/9.1 cm)，阳离子树脂提取纯化法得到的吴茱萸总碱Rf值为0.420(3.82 cm/9.1 cm)，吴茱萸碱标准品的Rf值为0.418(3.8 cm/9.1 cm)。

由图6可知，采用732阳离子树脂法提取的吴茱萸次碱在TLC上的显色点比采用传统方法提取的吴茱萸次碱在TLC上的显色点大，说明该阳离子树脂对吴茱萸次碱的吸附能力较强。采用阳离子树脂法提取的吴茱萸碱在TLC上的显色点与传统方法提取的吴茱萸碱在TLC上的显色点相差不大，说明732阳离子树脂对吴茱萸碱的吸附能力不是太强。根据产率公式=(得到的吴茱萸总碱含量)/(吴茱萸药材粉末总量)×100%，计算出传统方法得到的吴茱萸总碱产率为16.08%(8.04 g/50 g)。阳离子树脂纯化法得到的产率为16.18%(8.09 g/50 g)。

图6 传统提取法吴茱萸总碱、阳离子树脂法吴茱萸总碱与吴茱萸碱、吴茱萸次碱标准品TLC比较Fig.6 Comparison of total base extracted by traditional and cation exchange resin methods with standard reagents of evodiamine and rutaecarpin in TLC

由此可知，732型阳离子交换树脂纯化法提取吴茱萸总碱可以除去较多的杂质，使产物纯度明显提高。

2.2 吴茱萸总碱洗脱剂的选择 用不同洗脱剂对纯化后的吴茱萸总碱进行洗脱。见表2。

表2 洗脱剂种类对洗脱率的影响Tab.2 The influence of eluting efficacy from varied elute

由表2可知，用5%氨水进行洗脱，总碱洗脱率为55.45%，用5%/95%的氨性乙醇洗脱，总碱洗脱率为57.26%，用10%盐酸洗脱，总碱洗脱率为60.13%，用饱和氯化钠溶液洗脱，总碱洗脱率为61.14%。由此可知，4种洗脱剂对吴茱萸总碱的洗脱率存在一定的差异，饱和氯化钠溶液的洗脱效率最高，盐酸溶液次之，氨水和氨性乙醇溶液洗脱能力较低。且盐酸溶液在洗脱过程中，存在酸性腐蚀，因此，选用饱和氯化钠溶液作为吴茱萸总碱的最佳洗脱剂。

2.3 吴茱萸总碱的MTT试验 将上述得到的吴茱萸总碱，采用MTT比色法对U251乳腺癌细胞抑制其活性的研究，并考察了总碱在不同浓度条件下，对U251乳腺癌细胞抑制活性测试，见图7。从图7试验结果可知，吴茱萸总碱的细胞毒性对其浓度依赖性不强，即随着载体浓度的增加，细胞形态改变不大，凋亡细胞的数量增多不明显。当浓度为50 μmol/mL时，作用时间达24 h，细胞的存活率为68.1%(0.966/1.418)；随着载体浓度的增加，当作用浓度分别为100 μmol/mL和150 μmol/mL时，作用时间仍为24 h时，细胞的存活率无明显降低，分别为66.0%(0.870/1.318)和60.3%(0.873/1.448)。传统吴茱萸总碱相同浓度和作用时间下的细胞存活率分别为67.4%(0.812/1.205)，65.6%(0.910/1.387)和59.2(0.869/1.469)，由此可推断出纯化方法得到的吴茱萸总碱细胞存活率比传统方法得到的细胞存活率高。

图7 不同浓度的吴茱萸总碱与U251乳腺癌细胞共培养24 h细胞形态图(×40)Fig.7 Cellular shape picture of U251breast cancer cell done by different concentration of total evodiamine(×40)

3 结论

本文以中药材-吴茱萸果实为原料，并对传统提取法提取的吴茱萸总碱，与732型阳离子树脂纯化法得到的吴茱萸总碱进行对比研究，传统方法得到的吴茱萸总碱的产率为16.08%，732型阳离子树脂纯化法得到的吴茱萸总碱的产率为16.18%。由此对比得出732型阳离子树脂纯化法得到的总碱产率较高。在用TLC检测时，732型阳离子树脂纯化法的显色点比传统提取法少，因此纯度也明显提高。在此基础上，本文还探究了732型阳离子树脂纯化后对吴茱萸总碱洗脱时洗脱剂的选择，结果表明：采用饱和氯化钠溶液洗脱时，总碱洗脱率最高，达到61.14%。因此，筛选出饱和氯化钠溶液为最佳洗脱剂。本文的创新点在于用阳离子树脂纯化吴茱萸总碱，不仅避免了有毒溶剂氯仿的使用，而且纯度也明显提高；另外，还对吴茱萸总碱进行乳腺癌抑制其活性研究，此项研究目前未见报道，结果表明：细胞毒性对其浓度依赖性不强，随着载体浓度的增加，细胞形态改变不大，凋亡细胞的数量增多不明显。该研究通过应用较为简洁的提取方法，避免了毒性溶剂的使用，并对其生物活性成分进行评价，在中医药领域中，具有一定参考价值。

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(编校：王冬梅)

Separation and purification of total alkaloids fromEvodiarutaecarpausing 732 cation exchange resin and investigations on its anti-breast cancer bioactivity

CHEN Shi-xue, YAO Yuan-yong, LU Zhong-ying, TANG Bang-chengΔ

(Institute of Material and Chemical Engineering, Key Laboratory of Fanjing Mountain Special Animal and Plant Resources Tongren University, Tongren 554300, China)

ObjectiveTo optimize conditions for extraction of alkaloids fromEvodiarutaecarpaby means of 732 cation exchange resin and performe its anti-breast cancer bioactivity.MethodsThe optimum processing route on extraction of alkaloids fromEvodiarutaecarpawas investigated by means of 732 cation exchange resin.The performance of 732 cation exchange resin was compared with tranditonal process (aqueous extraction-ethanol precipitation in extraction-purification process).The alkaloid reagent-potassium mercuric iodide test and MTT test were performed on the crudes.ResultsCompared with traditional purification process, it was much better to use 732 cation exchange resin approach for extraction of alkaloids from Evodia rutaecarp with high yield(16.81%) The best eluent should be saturated brine with excellent purification.No obvious correlations were found between the toxin of breast cancer cell and concentration of total alkaloids.When the concentration of total alkaloids was 50 μmol/mL, cellular survival rate was 68%afterward 24 h.When the concentration of total alkaloids comes to 100 μmol/mL and 150 μmol/mL, cellular survival rates were slightly decreased by 66% and 60%.Conclusion732 cation exchange resin performes much higher than traditional process in purification of total alkaloids extracted fromEvodiarutaecarpa.Simultaneously, the extracted total alkaloids showe remarkable inhibition in breast cancer cell.

Evodiarutaecarpa; cation exchange resin; extraction process; total alkaloids

贵州省教育厅基金[黔教合KY(2011)005]；贵州省高等学校重点支持学科[黔教合重点支持学科字(2011)232]

陈仕学，女，硕士，副教授，研究方向：天然药物的提取及应用研究，E-mail：tongrencsx01@126.com；唐帮成，通讯作者，男，本科，副教授，研究方向：天然药物的提取，E-mail：1608096643@qq.com。

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1005-1678(2015)09-0015-04