芬太尼对胃癌细胞SGC-7901增殖影响及机制研究

张海芳，卫星，陈海华，张佳，石婷娟，王学玲

(1.运城市中心医院 消化内科，山西 运城 044000；2.山西省汾阳医院 消化内科，山西 汾阳 032200)



芬太尼对胃癌细胞SGC-7901增殖影响及机制研究

张海芳1Δ，卫星1，陈海华1，张佳1，石婷娟1，王学玲2

(1.运城市中心医院 消化内科，山西 运城 044000；2.山西省汾阳医院 消化内科，山西 汾阳 032200)

目的 探讨芬太尼对人胃癌细胞SGC-7901增殖影响及机制研究。方法 以0(对照组)、0.5、5、50 nmol/L 芬太尼作用胃癌细胞SGC-7901一定时间，MTT法检测芬太尼对SGC-7901细胞活力的影响；流式细胞术检测芬太尼对SGC-7901细胞周期的影响；Western blot检测细胞凋亡相关蛋白cyclinD1，Bcl-2的表达。结果 与对照组比较，0.5，5，50 nmol/L芬太尼可显著抑制细胞的活力，在48 h抑制程度最高。0.5，5，50 nmol/L芬太尼使细胞周期阻滞在G1期，与对照组相比，随着给药浓度的增加，芬太尼能显著抑制cyclinD1，Bcl-2的表达(P<0.05)。结论 芬太尼可抑制胃癌SGC-7901细胞增殖。

芬太尼；胃癌细胞SGC-7901；增殖；NF-κB信号通路

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率居各种癌症前列。并且与大多数癌症一样，预防和治疗效果都不佳。像大多数癌症一样，胃癌发病机制也较复杂，并受各种细胞信号通路影响。其中核因子-κB(NF-κB)信号通路与胃癌肿瘤的生长增殖密切相关[1]。细胞周期蛋白CyclinD1，CyclinA和凋亡相关蛋白Bax，Bcl-2是NF-κB信号通路的下游分子，NF-κB通路激活后，CyclinD1，CyclinA及Bcl-2会持续表达，促进肿瘤细胞的增殖，生长[2-4]。

在包括胃癌等癌症确诊时，有50%以上患者都有疼痛主诉[5]。芬太尼是阿片类镇痛药物，对解除患者疼痛具有良好效果[6-10]。芬太尼对于胃癌细胞的增殖抑制作用的具体分子生物学机制还未知。有文献报道，芬太尼可通过下调NF-κB通路，抑制结肠癌细胞HCT116，胃癌细胞MGC-803细胞增殖。推测芬太尼也可通过NF-κB途径来抑制胃癌细胞SGC-7901增殖，所以在此基础上本实验将阐述芬太尼对胃癌细胞SGC-7901增殖的具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人胃癌细胞SGC-7901购于中国科学院上海细胞库，目录号：TCHu46,培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中。

1.1.2 仪器：FACSCanto流式细胞仪购自美国BD公司；CO2培养箱，生化培养箱购自美国Themo 公司；双垂直电泳仪，转印电泳仪购自北京六一仪器厂，2000TM凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司，Elx800酶标仪购自美国BIOTEK公司。

1.1.3 试剂：兔抗Bax，Bcl-2，p21，CyclinD1，IκBα，p-IκBα单克隆抗体购自美国Epitmics公司；兔抗NF-κB p65，pp65购自Santa Cruz公司；细胞周期检测试剂盒，BCA试剂盒购，小鼠抗GADPH单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自碧云天生物技术研究所；ECL发光试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；胎牛血清，RPMI1640培养基，四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Gibco公司，胰酶购自美国Hyclone公司。枸橼酸芬太尼注射液购于江苏恩华药业股份有限公司，其主要有效成份为芬太尼。

1.2 方法

1.2.1 MTT法:用0.25%胰酶将处于对数生长期的胃癌细胞SGC-7901，消化，并将细胞浓度调整为4×104/mL，100 μL接种于96孔板，在37 ℃和5%CO2培养箱中培养24 h。加入含5%胎牛血清的RPMI1640培养基，芬太尼(终浓度为0.5，5，50 nmol/L)培养基，继续培养24，48，72 h，加MTT(5 mg/mL)20 μL，继续孵育4 h后，上清液去掉，并加入150 μL DMSO，振荡摇匀后，酶标仪570 nm处测定OD值。并计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.2.2 细胞周期检测：用0.25%胰酶将处于对数生长期的胃癌细胞SGC-7901，消化，并将细胞浓度调整为8×103/mL，1 mL接种于6孔板，在37 ℃和5%CO2培养箱中培养24 h。加入含5%胎牛血清的RPMI1640培养基，芬太尼(终浓度为0.5，5，50 nmol/L)，继续培养48 h，收集细胞。按细胞周期检测试剂盒说明书进行检测，将细胞固定于70%预冷的乙醇中，16 h，离心，PBS洗涤并重悬细胞，后加入3 mL碘化丙啶染色液，于37 ℃孵育30 min，并于当日进行流式检测。用FACSort Cell Quest软件(美国BD公司)进行DNA分析。

1.2.3 Western blot：用0.25%胰酶将处于对数生长期的胃癌细胞SGC-7901，消化，并将细胞浓度调整为8×103/mL，1 mL接种于6孔板，在37 ℃和5%CO2培养箱中培养24 h。加入含5%胎牛血清的RPMI1640培养基，芬太尼(终浓度为0.5，5，50 nmol/L)，继续培养48 h，收集细胞。加入预冷的RIPA裂解液裂解，冰浴30 min，每隔10 min震荡10 s，离心15 min，获得蛋白样品。用BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白变性，并上样，跑SDS凝胶电泳1.5～2 h，后湿法转膜40～60 min，以5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h，加入一抗(Bax，Bcl-2，p21，CyclinD1，NF-κB p65，pp65，IκBα，p-IκBα，稀释比例为1:100)4 ℃孵育过夜。次日TBST漂洗3次，加二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，(辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，稀释比例为1:500)，室温孵育1.5 h，后TBST漂洗3次，并将ECL发光液滴加于膜上，在凝胶成像系统中进行曝光，并用“Quantity one”软件对蛋白灰度值进行分析统计。

2 结果

2.1 芬太尼对胃癌SGC-7901细胞活力的影响 与对照组比较，0.5，5，50 nmol/L芬太尼能显著的抑制SGC-7901细胞活力，差异具有统计学意义(P<0.01)；并且同一剂量浓度随着给药时间的增加，芬太尼对SGC-7901细胞抑制强度也逐渐提高，在48、72 h抑制强度一致。见表1。

组别剂量(nmol/L)抑制率(%)24h48h72h对照组00.12±0.023.06±0.383.17±0.55芬太尼0.513.54±0.23*21.53±3.29*21.37±2.27*519.92±2.15*33.22±4.10*33.91±4.13*5030.78±3.38*45.34±5.63*45.26±5.34*F122.24065.39076.520P0.0000.0000.000

与对照组*P<0.05相比，compared with control group

2.2 芬太尼对胃癌细胞SGC-7901细胞周期的影响 与对照组比较，0.5，5，50 nmol/L芬太尼能使G1期细胞数目显著增多，差异具有统计学意义(P<0.01)；0.5，5，50 nmol/L芬太尼能使G2期的细胞明显减少，差异具有统计学意义(P<0.01)。从而说明芬太尼能阻滞SGC-7901细胞周期在G1期。见表2。

表2 芬太尼对胃癌SGC-7901细胞细胞周期影响Tab.2 Effect of fentanyl on cell cycle of gastric cancer SGC-7901 ±s，n=3)

*P<0.05与对照组相比，compared with control group

2.3 芬太尼对胃癌SGC-7901细胞cyclinD1，Bcl-2表达量的影响 与对照组相比，随着给药浓度的增加，芬太尼能显著抑制cyclinD1，Bcl-2的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 芬太尼对胃癌SGC-7901细胞cyclinD1，Bcl-2表达量的影响*P<0.05，**P<0.01，与对照组相比 Fig.1 Effect of expression of cyclinD1 and Bcl-2 of SGC-7901 cell by Fentanyl*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

3 讨论

肿瘤的增殖活性决定了它的恶性程度，增殖程度越高，肿瘤组织生长越快，越容易发生转移，恶性程度越高。因此，一定程度上抑制肿瘤细胞的增殖，可遏制肿瘤组织生长过快。本实验发现，在48 h，芬太尼可显著抑制胃癌细胞SGC-7901增殖，并呈剂量依赖性，与韦宁仙等[4]等的观点一致。

越来越多的研究发现NF-κB参与了肿瘤细胞增殖和凋亡[9]。NF-κB在大多数肿瘤组织中以活化形式存在，在肿瘤的发生发展中起重要作用[10]。NF-κB自身蛋白以及NF-κB所调节的一些蛋白与细胞的分化、增殖、凋亡皆有密切关系[11]。在胃癌细胞中NF-κB同样具有重要作用，在临床观察中发现，胃癌组织中NF-κB过表达，与患者的预后有密切关系[12]。通过抑制NF-κB的活化，可显著抑制胃癌细胞的增殖[5, 13]。

胃癌细胞的发生常伴随着细胞周期蛋白过度活化，导致细胞周期失控，细胞不可控制增殖。CyclinD1是常见的细胞周期蛋白，是NF-κB信号通路下游重要的效应分子，与肿瘤细胞的增殖密切相关[7]。Cyclin D1与胃癌患者临床分期，肿瘤分化，侵袭，DNA倍体情况，细胞S期分数密切相关[14]。干扰Cyclin D1表达能使肝癌细胞HepG2细胞周期阻滞在G1期[15]。孙辉平等[16]也证实一定剂量的瑞芬太尼能使肝癌细胞HepG2阻滞在G1期，进而抑制细胞增殖。本实验结果也发现，与胃癌细胞SGC-7901对照组相比，芬太尼作用后，cyclin D1表达减弱，细胞周期阻滞在G1期。在细胞凋亡的过程中，Bcl-2家族蛋白在凋亡过程中起着关键作用，Bcl-2是其家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白，可以通过与促凋亡蛋白成员Bax形成异源二聚体作用于线粒体外膜，以阻止线粒体释放Caspase来影响细胞凋亡。Bcl-2在胃癌患者中过表达，与胃癌的发展发展及预后有密切关系[17]。Bcl-2 siRNA 可显著促进胃癌细胞SGC-7901的凋亡[18]。本实验通过芬太尼作用胃癌细胞SGC-7901发现，与对照组相比，芬太尼能显著下调Bcl-2的表达，并呈剂量依赖性。

综上所述，芬太尼可通过抑制Bcl-2和cyclinD1的表达量，阻碍细胞周期的正常进行，进而抑制胃癌SGC-7901细胞增殖。

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(编校：谭玲)

Study of mechnism and effect of fentanyl on proliferation in gastric cancer cell SGC-7901

ZHANG Hai-fang1Δ, WEI Xing1, CHEN Hai-hua1, ZHANG Jia1, SHI Ting-juan1, WANG Xue-ling2

(1.Department of Gastroenterology, Yuncheng Central Hospital, Yuncheng 044000, China; 2.Department of Gastroenterology, Fenyang hospital of Shanxi Province, Fenyang 032200, China)

ObjectiveTo explore mechnism and effect of fentanyl on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cell.MethodsGastric cancer SGC-7901 cell was cultured with fentanyl of 0 (negative control), 0.5, 5 and 50 nmol/L, MTT method was used to detect the effect of fentanyl on SGC-7901 viability.The effect of fentanyl on SGC-7901 cell cycle was measured by flow cytometry.The level of cell related protein,cell cycle protein cyclin D1, Bcl-2.ResultsCompared with control group, fentanyl (0.5, 5, 50 nmol/L) could inhibit SGC-7901 cell viability, and the inhibitory rate was highest at 48 h.0.5, 5, 50 nmol/L fentanyl made cell cycle arrested in G1 phase.Compared with control group, fentanyl can significantly inhibit cyclinD1 and Bcl-2 expression with drug concentration increasing(P<0.05).ConclusionThese results suggeste fentanyl inhibit proliferation of gastric cancer SGC-7901 cell.

fentanyl; gastric cancer cell SGC-7901; proliferation; NF-κB signal pathway

中国肝炎防治基金会天晴肝病研究基金 (TQGB20120013)

张海芳，通讯作者，女，本科，副主任医师，研究方向：消化道早癌的诊断及治疗，E-mail：zhanghaifang8389@163.com。

R735.2

A

1005-1678(2015)09-0038-03