广西白裤瑶线粒体DNA HVRⅠ区多态性分析

吴群英 莫小梅 黄岚珍 王凌宇 黄 江 肖福英

（桂林医学院生物技术学院，广西 桂林 541004）

白裤瑶是瑶族中民族特色保留较为完整的支系之一，自称“努格劳”，因其男子穿及膝的白裤而得名“白裤瑶”,主要集居在广西南丹县和贵州荔波县相接壤的里湖瑶族乡、八圩瑶族乡和瑶山瑶族乡等地[1]。人类线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是一个由16569个碱基组成的闭合环状双链分子，由于母系遗传的特性，缺乏重组、进化速率高、群体内变异大等特点，而被广泛地应用于人类群体的起源、演化和亲缘关系以及疾病的遗传的研究。本文采用聚合酶链反应(PCR）技术及DNA测序法对广西南丹白裤瑶族mtDNA D-Loop HVRⅠ区进行了研究,为少数民族群体遗传学研究提供新的数据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

31名体检健康的白裤瑶样本均采自广西河池市南丹县，彼此间无亲缘关系，3代均为白裤瑶族，所有研究对象均知情同意。

1.2 mtDNA的提取

用消毒棉签刮取口腔黏膜细胞，浸泡于生理盐水中，将采集口腔黏膜细胞的棉签用生理盐水把口腔细胞清洗出来于1.5mlEP管中，进行13000 rpm，离心15min，小心弃去上清，然后加入200ul 10%chelex100树脂，56℃水浴30min，取出后振荡5-10s,100℃水浴 10min，离心3min，4℃保存，上清用于PCR扩增。

1.3 HVRⅠ区的PCR扩增

PCR反应总体积为 50ul，引物各 1 umol/L,上游引物：5’-TTAACTCCACCA -TTACCACC -3’， 下 游 引 物 ：5’ -GAGGATGGTGGTCAAGGGAC-3’（由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增片段长度为 440bp），2×Taq PCR Master Mix 25ul,DNA模板5ul，去离子水补足50 ul。反应条件：94℃预变性1min，94℃变性30s，58℃退火 30s，72℃延伸 30s，30个循环后 72℃延伸 10min。

1.4 PCR产物的检测及测序

每个样品均取10μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察扩增结果；40ulPCR产物委托上海立菲生物技术有限公司进行测序。

1.5 统计学分析

测序结果与剑桥标准Anderson序列比较，统计变异位点及变异类型。按照公式P=∑x2(x为每个个体单倍型频率)计算偶合概率,按公式h=(1-∑x2)n/(n-1)(n为样本含量)计算基因变异度。

2 结果

2.1 HVRⅠ区的PCR扩增

用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小及纯度，结果表明，31例白裤瑶样本均成功扩增，扩增片段大小为440bp（见图1）。

图1 HVR I区的PCR扩增电泳结果

2.2 HVRⅠ区的多态性

将31例白裤瑶族HVRⅠ区的PCR扩增产物测序后，所得的核苷酸序列分别与Anderson标准序列进行比较，共检测出88个突变位点，其中以碱基置换为主，包括30个碱基转换，57个碱基颠换，1个碱基缺失，1个碱基插入。碱基颠换明显高于碱基转换、插入及缺失，碱基颠换占总碱基变异的64.77%，其中A-C的颠换占总碱基变异的39.44%（见图 2）。

图2 HVRⅠ区测序的核苷酸序列与Anderson标准序列对比结果

2.3 HVRⅠⅠ区基因变异度和偶合概率结果

按照公式P=∑x2(x为每个个体单倍型频率)计算偶合概率,公式h=(1-∑x2)n/(n-1)(n为样本含量)计算基因变异度[2]。计算得出偶合概率为0.25，基因变异度分别为1.00。由此说明，广西白裤瑶族线粒体DNA HVRⅠ区具有较高的序列多态性。

2.4 mtDNA HVRⅠ区14bp高变结构域

Anderson序列在16180-16193位置有一个14bp富含C的高变结构域,连续9个C被16189位点的T隔开,其长度及序列因受碱基插入、缺失、转换、颠换等影响而出现个体间序列多态性,该区域也具有典型的人类学特征。本研究出现3种单倍型,分别为：AAAACCCCCTCCCC(2个),AAAACCCCCTCCTC（1 个),AACCCCCCCCCCCC(1 个)。

3 讨论

线粒体DNA D-loop环区在人类学研究上是非常有价值的DNA区段,比较研究相应区段的序列间差异和变异速率,可以获得丰富的进化信息,为人类起源、进化和人群的迁移提供可靠的遗传信息。本研究选择广西白裤瑶族群体进行线粒体HVRⅠ区序列分析,研究结果表明在线粒体DNA HVRⅠ区有多个碱基突变,这表明广西白裤瑶线粒体DNA HVRⅠ区具有高度序列多态性,可以作为法医学个体识别的遗传标记。从广西白裤瑶族线粒体DNA HVRⅠ区碱基突变类型来看，突变以碱基颠换为主，然而HVRⅢ区碱基突变却是以碱基转换为主,以嘧啶(T-C)之间的转换最多,这个结果支持mtDNA的突变是由于DNA在复制时错配所造成[3]。

本研究中发现白裤瑶族的有些位点与其他东亚人群间确实存在差异,白裤瑶族人在nt16093及nt16183位置分别出现T-C和A-C碱基替换,而中国汉族人[5]、日本人[6]、朝鲜人[7]却未发现上述部位的碱基突变,表明白裤瑶族在进化过程中保留了其独特的遗传特征。此外,由于nt16189位出现T-C碱基转换导致nt16180-16193区域形成的的poly-C(C重复)序列,日本人[6]、朝鲜人[7]分别有16、19种单倍型,白裤瑶族只有3种。白裤瑶族单倍型少,是否与样本量有关,还需要进一步证实。

［1］田培燕,陈应康,罗惠,等.白裤瑶人群12对遗传性状的基因频率[J].现代预防医学,2009,36(8).

［2］Tajima F.Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism[J].Genetics,1989,123:585-595.

［3］Bendall KE,Sykes BC.Length heteroplasmy in the first hypervariable segment of the human mtDNA control region[J].Am J Hum Genet,1995,57(2):248-256.

［4］刘雅诚,严江伟,唐晖,等.中国5个民族 mtDNA(CA)n重复的多态性[J].中国法医学杂志,2003,18(1):37-38.

［5］Nishimaki Y,Sato K,Fang L,etal.Sequence polymorphism in the mtDNA HVS-I region in Japanese and Chinese[J].Legal Med,1999,1(4):238-249.

［6］Horai S,Hayasaka K.Intraspecific nucleotide sequence differences in the major noncoding region of human mitochondria DNA[J].Am J H um Gen et,1990,46(4):828-842.

［7］Lee SD,Shin CH,Kim KB,etal.Sequence variation of mitochondrial DNA control region in Korean s[J].Forensic Sci Int,1997,87(2):99-116.

［8］Poulton J,Luan J,Macaulay V,et al.Type 2 diabetes is associated with a common mitochondrial variant:evidence from a population-based case-control study[J].Hum Mol Genet,2002,Jun 15,11(13):1581-1583.