干旱胁迫下棉花幼苗转录因子BES1／BZR1对外源油菜素内酯的响应表达特征

安汶铠，常 丹，张富春

（新疆大学 生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046）

棉花作为新疆的主要经济作物，干旱是制约新疆棉区棉花产量和品质的主要环境因素之一。油菜素内酯（Brassinosteroid，BR）作为一种影响植物生长发育和抗逆的植物内源激素，在提高植物抗盐、抗旱、耐高温以及调节植物衰老等生理功能方面发挥重要作用［1－2］。研究表明BR能够广泛参与植物各种生理过程，调控植物生长发育以及对逆境条件下的生理响应［3－6］。经过BR喷施处理后，植物叶片含水量增加，叶片水势提高，且植物的蒸腾作用明显降低，这样既保持了细胞膨压，又能够缓解干旱胁迫，改善植物细胞中的水分状况，提高植物在干旱胁迫下的生存能力。近年来，随着BR 促进植物抗逆性研究的深入，BR已经被广泛应用于农林业的生产中［7－12］。

BZR1／BES1是BR 信号通路中一种重要的转录因子，与BR 结合后使得BRI1的羧端磷酸化，调控BKI1（BRI1kinase inhibitor1）从质膜上解离下来，使BRI1 与共受体BAK1（BRI1－associated receptor kinase）结 合［13－14］，并 形 成 异 源 二 聚 体，进 而通过相互磷酸化完全激活BR 信号通路［15］，异二聚体BRI1－BAK1可使得BSK 激活，BSK 又能够活化BSU11（BRI 1suppressor 1），BSU1 可 使 下 游 的BIN2 （Brassinosteroid－insensitive 2）失 活［16］，而BIN2则影响BZR1／BES1的磷酸化［17］。Kim 等发现磷酸化后的BZR1／BES1 失去了核输出以及与DNA 结合的能力，并且可被蛋白酶降解，被激活的BSU1可以使BIN2的Tyr磷酸化位点去磷酸化从而抑制其活性，使得BZR1／BES1 被蛋白磷酸2A（PP2A）去磷酸化，最终在细胞核内大量积累［18］。核内聚集的BZR1／BES1能够与下游基因启动子上特定区域结合，激活转录，从而调节BR 靶基因的表达，最终调节植物的生长、发育和抗逆性能［19］。因此研究BR 信号通路中基因BZR1／BES1的表达调控机理显得尤为重要。

本研究以新疆的主栽棉花品种‘新陆早17号’的幼苗为材料，根据亚洲棉‘石系亚1号’的转录组测序中转录因子BES1／BZR1基因的开放阅读框序列［20］，通过PCR 克隆获BES1／BZR1转录因子基因，命名为GhBES1／BZR1（GenBank登录号KP272000）；在生物信息学分析的基础上，进一步探讨干旱胁迫下用油菜素内酯及油菜素内酯抑制剂（Z）处理棉花后，Gh－BES1／BZR1的表达变化规律，研究外源喷施植物激素BR对干旱胁迫下棉花GhBES1／BZR1表达的影响，揭示BR提高棉花抗旱能力的分子机制，为棉花生产中合理使用BR提供依据。

1 材料和方法

1．1 实验材料

棉花‘新陆早17号’种子由新疆农业科学院经济作物研究所玛纳斯实验站提供。挑选籽粒饱满大小一致的棉花种子，用70%乙醇消毒1min，蒸馏水冲洗3～4次，用15%过氧化氢浸种5h，再用蒸馏水冲洗3～4次，播种到固体MS培养基中，进行无菌培养，10d 后将棉花幼苗转至Hoagland 营养液［21］中继续进行液体培养，每隔5～7d换1次营养液，以5～6片真叶期的棉花幼苗为实验材料。

1．2 方 法

1．2．1 实验材料的处理 待棉花幼苗生长至5～6片真叶期时，用2．5% PEG－6000干旱胁迫处理24 h后，分别用水、BR（0．5mg／L）和Z（1．0mg／L，BR抑制剂）喷施。具体处理组为：（1）Hoagland营养液＋蒸馏水为对照组（CK）；（2）含2．5%PEG－6000的Hoagland营养液＋蒸馏水（PEG）；（3）Hoagland营养液＋0．5mg／L BR（BR）；（4）含2．5%PEG－6000的Hoagland营养液＋0．5 mg／L BR（PEG＋BR）；（5）含2．5% PEG－6000的Hoagland营养液＋0．5 mg／L BR＋1．0 mg／L Z（PEG＋BR＋Z）；（6）含2．5%PEG－6000的Hoagland营养液＋1．0 mg／L Z（PEG＋Z）。每隔3h进行1次喷洒处理，在0、3、6、12、24h时采集不同处理的不同棉花幼苗底部倒数第3～4片的10个叶片，分别称取0．1g棉花幼苗叶片，迅速冻于液氮中备用。

1．2．2 棉花幼苗总RNA 的提取和cDNA的合成 取0．1g棉花幼苗叶片在液氮中充分研磨，采用植物总RNA 提取试剂盒（北京百泰克公司）提取棉花总RNA，接着进行定量和电泳检测。采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（大连TaKa－Ra公司）试剂盒合成cDNA。

1．2．3 GhBES1／BZR1 基因的扩增和鉴定 根据亚洲棉‘石系亚1号’转录因子BES1／BZR1的开放阅读框序列，设计扩增开放阅读框的上游引物（5′－GCGCTGCTTTGAGGAAGGTATTG－3′）和 下 游引 物（5′－CTGACAGTGTTTGCTTGATGTGATGCTC－3′），以棉花幼苗叶片的cDNA 为模板，使用ExTaq酶PCR 扩增目的基因，扩增条件为94 ℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s；72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的基因片段，与pMD18－T 载体连接，并转化E．coli DH5α感受态细胞。挑选菌液进行PCR 及质粒酶切鉴定的阳性克隆，送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1．2．4 GhBES1／BZR1 蛋白生物信息学分析 利用ExPASy ProtParam（http：／／expasy．org／tools／pi＿tool．html）分析GhBES1／BZR1蛋白的理化性质及疏水性；用NCBI CDD 数据库分析蛋白质的保守结构域，用SignalP4．0Server（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／SignalP）软件预测蛋白质的信号肽；Cell－PLoc 2．0PSORT（http：／／psort．ims．u－tokyo．ac．jp／form．html）预测蛋白质的亚细胞定位；GOR4（http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa＿automat．pl）软件预测蛋白质二级结构；NetPhos（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／NetPhos）分析蛋白质的磷酸化位点；NPS Prosite Scan（http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／pattern＿prosite．pl）分析蛋白活性位点；用MEGA 5．0软件构建系统进化树［22－23］。

1．2．5 不同处理GhBES1／BZR1基因的表达 根据GhBES1／BZR1的cDNA 序列设计上游引物（5′－TGGGATGAAATGAATGCTGGGC－3′）和下游引物（5′－AGTGTAAGTTCGAGATCATCAGCTGC－3′），以18S基因作为内参基因，设计上游引物（5′－CAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTT－3′）和下游引物（5′－CAAGGAATCGAAACGAAAGAAGG－3′）。以处理组棉花幼苗叶片的cDNA 为模板，取1．0μL cDNA，qRT－PCR 参照带有ROX 的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix－UDG（美国Invitrogen公司）试剂盒说明书进行。RT－PCR 反应参数为：94 ℃预变性15s；94 ℃变性30s；59 ℃退火30s；72 ℃延 伸45s；40 个 循 环。采 用ABI PRISM 7500实时定量PCR 仪进行检测，数据采用2－ΔΔCT法进行分析［24］。

2 结果与分析

2．1 GhBES1／BZR1基因的克隆和鉴定

以棉花‘新陆早17号’幼苗叶片的cDNA 为模板，以根据BES1／BZR1基因开放阅读框序列设计的特异性引物，通过PCR 进行GhBES1／BZR1 开放阅读框的扩增。结果表明PCR 扩增出与预测长度一致的条带（图1），测序结果表明开放阅读框为960bp，编码319 个氨基酸，提交NCBI 基因库（GenBank登录号KP272000），所获得的GhBES1／BZR1基因为正确的目的基因。

2．2 GhBES1／BZR1蛋白的理化特性和结构分析

通过在线EXPASY 的ProtParam 软件对BES1／BZR1基因编码蛋白的理化性质进行分析表明，GhBES1／BZR1蛋白的理论分子量为34．3kD，理论等电点为8．95。利用在线NCBI的保守结构域数据库（conserved domain database，CDD）对Gh－BES1／BZR1蛋白的保守结构域进行预测，结果说明GhBES1／BZR1蛋白含有一个DUF822 保守结构域，而DUF822为基因未知功能的植物蛋白，此家族由未知功能的几个植物蛋白的N 末端区域组成。利用SignalP4．0Server软件对GhBES1／BZR1 蛋白进行信号肽的预测。结果说明GhBES1／BZR1蛋白的N 端不存在剪切位点，表明其不包含信号肽，推测GhBES1／BZR1蛋白为非分泌蛋白。利用在线EXPASY 的ProtParam 软 件 对GhBES1／BZR1 蛋白的疏水性／亲水性进行预测。推测GhBES1／BZR1蛋白是一种可溶性蛋白。利用在线软件GOR4对GhBES1／BZR1 蛋白的二级结构进行预测。结果表明，GhBES1／BZR1蛋白主要由α－螺旋、无规则卷曲、延伸链构成（表1）。其中无规则卷曲结构最多，占据整条链的62．07%。α－螺旋占了24．76%，其余的全为延伸链。

图1 GhBES1／BZR1基因的PCR 扩增Fig．1 PCR amplification of GhBES1／BZR1gene M．DL2000；1，2．GhBES1／BZR1

表1 GhBES1／BZR1蛋白的二级结构预测Table 1 GhBES1／BZR1protein of secondary structure prediction

2．3 GhBES1／BZR1 蛋白质磷酸化位点及活性位点的分析

磷酸化是生物体内的一种重要调节方式，主要在细胞信号转导和蛋白调控过程中发挥作用［25］。利用NPS（network protein sequence analysis）的Prosite Scan对GhBES1／BZR1蛋白进行活性位点分 析。如 表2 所 示，GhBES1／BZR1 有3 类 磷 酸 化位点和1类N－糖基化位点、1类酰胺化位点和1类豆蔻酰化位点。

2．4 GhBES1／BZR1蛋白的系统进化树

通过NCBI数据库检索GhBES1／BZR1同源蛋白序列，使用MEGA 5．0软件构建系统进化树。其结果表明GhBES1／BZR1 蛋白和可可聚类在一起（图2），Blast比对编码棉花和可可这两种植物同源蛋白的序列相似度达到99%。

2．5 干旱胁迫下不同处理GhBES1／BZR1基因的表达分析

采用qRT－PCR 方法，以18S作为内参基因，分别检测不同处理和不同时间棉花幼苗叶片Gh－BES1／BZR1的表达变化（图3）。

实验结果表明，处理3h时，PEG－6000处理相对于水处理的GhBES1／BZR1 基因表达量极显著地上调了3．9倍（P＜0．01），PEG－6000处理下喷洒BR（PEG＋BR）相对于其他处理基因的表达量最高，而PEG＋BR 处理下再喷洒BR 抑制剂（PEG＋BR＋Z）相对于PEG＋BR 处理有显著性的降低（P＜0．05）。说明PEG 处理下喷施BR 能够显著提高GhBES1／BZR1的表达，而喷施BR 抑制剂后Gh－BES1／BZR1的表达显著降低。处理6h时，PEG＋BR 处理的基因表达量相对于其他处理是最高，除PEG 处理和PEG＋BR 处理外，其它处理下该基因的表达量都有所上升，PEG＋BR 处理的基因表达量有所下降，但相互之间都无显著性差异（P ＞0．05）。说明在6h直接喷施BR 和在PEG－6000处理下喷施BR 均能够显著提高GhBES1／BZR1，而喷施BR 抑制剂后GhBES1／BZR1的表达也显著降低。处理12h时，各处理的GhBES1／BZR1表达量相对于6h处理都有所下降，而PEG＋BR 处理的基因表达量依然最高，并显著性地高于PEG－6000处理和PEG＋BR＋Z 处理（P＜0．05），分别是其1．3和1．6倍。处理24h时，PEG＋BR 处理的基因表达量降低，直接喷施BR 处理的基因表达量达到最高。而PEG＋Z和PEG＋BR＋Z处理的基因表达量只有BR 处理组的1／7 左右。说明随着PEG处理时间的延长，在PEG 处理下喷施BRGhBES1／BZR1的表达明显下降，而喷施BR 抑制剂后Gh－BES1／BZR1的表达更加显著降低，已经低于对照组，说明随着处理时间的延长，BR 抑制剂极大地降低了GhBES1／BZR1的表达。

表2 GhBES1／BZR1在NPS中活性位点预测分析Table 2 The prediction analysis of GhBES1／BZR1active site in NPS

图3 干旱胁迫下不同处理‘新陆早17号’棉花幼苗叶片中GhBES1／BZR1的相对表达不同小写字母表示同一时间不同处理下差异显著（P＜0．05）Fig．3 Relative expression of GhBES1／BZR1 in the seedling leaves of cotton‘XLZ17’for the different treatments under drought stress Different letters represent significant differences among treatments under the same time（P＜0．05）

3 讨 论

BR 作为一种重要的植物内源激素，在植物的生长发育和抵御干旱方面发挥作用。BES1／BZR1作为BR 信号通路中的一种重要的转录因子，其编码的BES1／BZR1蛋白是植物防御的一种内源信号分子，当植物受到各种胁迫时，可以诱导防御基因的表达去抵御外界的胁迫，并直接影响植物的生长发育同时调节植物的生理代谢过程［26－27］。

通过对棉花‘新陆早17号’GhBES1／BZR1 基因序列的生物信息学分析表明，该基因编码蛋白质的氨基酸序列与可可编码的BES1／BZR1氨基酸序列的相似性达99%，且与可可的BES1／BZR1聚在进化树的同一分支上，这表明其进化上与可可具有趋同性。利用NPS的Prosite Scan 对BES1／BZR1蛋白进行活性位点分析结果表明，GhBES1／BZR1有3类磷酸化，这可能是与GhBES1／BZR1蛋白的磷酸化参与调解干旱胁迫的信号通路有关。蛋白质的疏水性通常依据蛋白的GRAVY 值预测，而GRAVY 值通常分布在－2～2之间，正值表明蛋白为疏水蛋白，负值表明为亲水蛋白。预测显示Gh－BES1／BZR1蛋白的GRAVY 值为－4．211，说明GhBES1／BZR1 蛋白是一种可溶性蛋白，结果与BES1／BZR1蛋白不与膜结合在细胞核内与特定启动子发挥作用的结果相一致［13］。表明该蛋白可能是一种能够通过磷酸化和去磷酸化在BR 信号通路中发挥作用的可溶性蛋白。

BR 在作物上的应用主要是浸种或外源喷等，有关BR 信号转导途径中的重要组分如GhBES1／BZR1基因表达变化对作物抗旱性的影响鲜见报道。根据河南棉花所对亚洲棉进行干旱胁迫下的转录组分析发现，BR 信号通路中BES、BKI、BRI 等基因的表达上调，其中PEG 模拟干旱胁迫3h后，亚洲棉‘石系亚1 号’叶中GhBES1／BZR1 表达量上调了2．7 倍［20］。本研究结果中，PEG－6000模拟干旱胁迫，PEG＋BR 处理3h 时GhBES1／BZR1基因的表达量分别是PEG 和PEG＋BR＋Z处理的1．9倍和1．7倍。BR 处理6和12h时，GhBES1／BZR1表达量相对于3h时都有明显下降，但喷施BR 表达量明显高于没有喷施BR 处理组，而BR＋Z处理GhBES1／BZR1表达量降低，这说明喷施BR能够诱导GhBES1／BZR1表达上调，而BR 抑制剂Z能够干涉BR 的作用致使GhBES1／BZR1表达下降。喷施BR 处 理 下3h 时，GhBES1／BZR1 表 达量快速升高，表明在干旱胁迫下喷施BR 能够让GhBES1／BZR1表达快速升高以响应干旱胁迫。而喷 施BR 6、12 和24h 相 对 于3h 处 理GhBES1／BZR1表达有所下降，则表明在干旱胁迫下喷施BR对于GhBES1／BZR1表达的影响在时间上没有持久性，伴随着时间的延长诱导作用逐渐减弱，与植物激素作用快的特性相一致。在没有干旱胁迫而单独喷施BR 处理24h时，GhBES1／BZR1表达量远高于干旱胁迫下喷施BR 处理。说明干旱胁迫下喷施BR 可快速诱导GhBES1／BZR1 表达，但在没有干旱胁迫下喷施BR 诱导GhBES1／BZR1表达明显存在一定的滞后性，证明干旱胁迫下喷施BR 是Gh－BES1／BZR1快速表达诱导因素。

总之，从棉花‘新陆早17号’幼苗中克隆获得的转录因子GhBES1／BZR1，在BR 信号通路的基因调控中发挥重要作用，在干旱胁迫下外源喷施BR及BR 抑制剂Z对棉花GhBES1／BZR1基因表达有明显的影响。表明BR 是促进干旱胁迫下Gh－BES1／BZR1表达的主要诱因，干旱胁迫和非干旱胁迫喷施BR 能够直接影响GhBES1／BZR1表达水平升高的速率。进一步探讨外源喷施BR 对棉花GhBES1／BZR1表达的影响，有助于阐明BR 调控棉花抗旱性的分子机理。

［1］ GUO H Q（郭慧琴），REN W B（任卫波），LI P（李 平），et al．Effect of epi－brassinosteroid and gibberellin on seed germination and seedling growth of Leymus chinensis［J］．Pratacultutal Science（草业科学），2014，31（6）：1 097－1 103（in Chinese）．

［2］ BAJGUZ A，HAYAT S．Effects of brassinosteroids on the plant responses to environmental stresses［J］．Plant Physiology and Biochemistry，2009，47（1）：1－8．

［3］ WANG H H（王 红红），LI K R（李凯荣），HOU H W（侯华伟），et al．Research progress of plant stress－resistance promoting related to brassinolides［J］．Agricultural Research in the Arid Areas（干旱地区农业研究），2005，23（3）：213－219（in Chinese）．

［4］ LI K R（李凯荣），FAN J SH（樊金栓）．Research progress brassinosteroid lactones－the new plant hormone in forestry［J］．Agricultural Research in the Arid Areas（干旱地区农业研究），1998，16（4）：104－109（in Chinese）．

［5］ SAIRAM R K．Effects of homobrassinolide application on plant metabolism and grain yield under irrigated and moisture－stress conditions of two wheat varieties［J］．Plant Growth Regulation，1994，14（2）：173－181．

［6］ LI K R，WANG H H，HAN G，et al．Effects of brassinolide on the survival，growth and drought resistance of Robinia pseudoacacia seedlings under water stress［J］．New Forests，2007，35（3）：255－266．

［7］ ZHANG M C，ZHAI Z X，TIAN X L，et al．Brassinolide alleviated the adverse effect of water deficits on photosynthesis and the antioxidant of soybean（Glycine max L．）［J］．Plant Growth Regulation，2008，56（3）：257－264．

［8］ FAROOQ M，WAHID A，BASRA S M A，et al．Improving water relations and gas exchange with brassinosteroids in rice under drought stress［J］．Journal of Agronomy and Crop Science，2009，195（4）：262－269．

［9］ XU F F（徐芬芬），XU W H（徐卫红）．Induction of resistance to downy mildew in Brassica campestis ssp．chinensis L．by brassinolide［J］．Journal of Henan Agricultural Sciences（河南农业科学），2013，49（5）：658－665（in Chinese）．

［10］ WU X X（吴雪霞），ZHA D SH（查丁石），et al．Effects of exogenous 24－epibrassinolide on plant growth and antioxidant system in eggplant seedlings under high temperature stress［J］．Plant Physiology Journal（植物生理学报），2013，49（9）：929－934（in Chinese）．

［11］ 黄鲤娴．BR 相关基因转化水稻及转基因植株的耐盐性分析［D］．福州：福建农林大学，2012．

［12］ QIAN W J（钱文静），LIU J（刘 静），SONG D（宋 丹），et al．Research progress on brassinosteroid related genes and their functions in rice［J］．Journal of Henan Agricultural Sciences（河南农业科学），2013，42（9）：1－5（in Chinese）．

［13］ XIONG J L（熊俊兰），KONG H Y（孔海燕），SONG D（宋 丹），et al．Effects of brassinosteroids on plant drought adaptability and their regulatory mechanism［J］．Journal of Lanzhou University（兰州大学学报），2013，49（5）：658－666（in Chinese）．

［14］ WANG X L，CHORY J．Brassinosteroids regulate dissociation of BKI1，a negative regulator of BRI1signaling，from the plasma membrane［J］．Science，2006，313（5 790）：1 118－1 122．

［15］ NAM K H，LI J．BRI1／BAK1，a receptor kinase pair mediating brassinosteroid signaling［J］．Cell，2002，110（2）：203－212．

［16］ TANG W Q，KIM T W，OSES P J A，et al．BSKs mediate signal transduction from the receptor kinase BRI1in Arabidopsis［J］．Science，2008，321（5 888）：557－560．

［17］ KIM T W，GUAN S H，SUN Y，et al．Brassinosteroid signal transduction from cell－surface receptor kinases to nuclear transcription factors［J］．Nature Cell Biology，2009，11（10）：1 254－1 260．

［18］ TANG W Q，YUAN M，WANG R J，eta l．PP2Aactivates brassinosteroid－responsive gene expression and plant growth by dephospho－rylating BZR1［J］．Nature Cell Biology，2011，13（2）：124－131．

［19］ HE J X，GENDRON J M，SUN Y，et al．BZR1is a t transcriptional repressor with dual roles in brassinosteroid homeostasis and growth responses［J］．Science，2005，307（5 715）：1 634－1 638．

［20］ ZHANG X，YAO D，WANG Q，XU W，WEI Q，et al．mRNA－seq analysis of the Gossypium arboreumtranscriptome reveals tissue selective signaling in response to water stress during seedling stage［J］．PLoS ONE，2013，8（1）：e54762．

［21］ MUHEREPIYA A（木合热皮亚．艾尔肯），ZHANG F CH（张富春）．Physiological and biochemical analysis for the salt tolerance of transgenic cotton transformed by the vacuolar H＋－Pyrophosphatase gene（VP1）from Halostachys caspicas［J］．Xinjiang Agricultural Sciences（新疆农业科学），2013，50（6）：1 016－1 023．

［22］ MA Y B（马燕斌），WU X（吴 霞），WANG X（王 霞），et al．Specific expression of BnDGAT1gene in Brassica napus［J］．Acta Bot．Boreal．－Occident．Sin．（西北植物学报），2013，33（10）：1 958－1 963（in Chinese）．

［23］ CUI B（崔 波），JIANG S H（蒋素华），LIU J（刘 佳），et al．Cloning and expression analysis of AP1－like gene fromSedirea japonica［J］．Acta Bot．Boreal．－Occident．Sin．（西北植物学报），2013，33（9）：1 739－1 744（in Chinese）．

［24］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D．Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2－ΔΔCT method［J］．Methods，2001，25（4）：402－408．

［25］ CHANG D（常 丹），ZHANG X（张 霞），ZHANG F CH（张富春）et al．Cloning and expression analysis of HcPEAMTgene from Halostachys caspica［J］．Acta Bot．Boreal．－Occident．Sin．（西北植物学报），2014，34（8）：1 522－1 528（in Chinese）．

［26］ KRISHNA P．Brassinosteroid－mediated stress responses［J］．Journal of Plant Growth Regulation，2003，22（4）：289－297．

［27］ BAJGUZ A．Effect of brassinosteroids on nucleic acid and protein content in cultured cells of Chlorella vulgaris［J］．Plant Physiology Biochemistry，2000，38（3）：209－215．