含氮表面活性剂促进矿物润滑油生物降解的作用与机制

韦友亮，陈波水，王 九，张 楠，方建华，吴 江

(1. 78416部队， 重庆 400054； 2. 后勤工程学院 军事油料应用与管理工程系，重庆 401311)

含氮表面活性剂促进矿物润滑油生物降解的作用与机制

韦友亮1，陈波水2，王 九2，张 楠2，方建华2，吴 江2

(1. 78416部队， 重庆 400054； 2. 后勤工程学院 军事油料应用与管理工程系，重庆 401311)

以液体石蜡模拟矿物润滑油基础油，通过生物降解实验考察了脂肪酸乙醇胺、脂肪酸酰胺、羟乙基咪唑啉、酰基氧化胺4种含氮表面活性剂对其生物降解性的影响，分别采用紫外-可见光分光光度计和表面张力仪测定了液体石蜡生物降解体系在600 nm波长处的光密度和油-水界面张力。结果表明，4种含氮表面活性剂均可显著提高液体石蜡的生物降解性，其中酰基氧化胺的效果最好；当其以质量分数1.0%加入液体石蜡时，可使后者的生物降解率由33.76%提高至72.13%。生物降解过程中，含氮表面活性剂显著降低体系的油-水界面张力并加速微生物生长，从而起到促进润滑油生物降解之作用。

含氮表面活性剂；矿物润滑油；液体石蜡；生物降解

矿物润滑油是应用最广泛的润滑剂品种之一。但是，由于其生物降解性差[1]，因渗透、泄漏、溢出和回收不当等导致的生态系统污染十分严重。研究改善其生物降解的技术措施，对于降低生态系统污染具有重要的理论和现实意义。

烃类化合物的生物降解性与其所处的环境状态密切相关，改变环境状态可使本来难降解的化合物变得易于降解。环境微生物学的研究表明，某些含氮和/或含磷化合物可加快微生物繁殖，增强其活性，促进难降解化合物的生物降解[2-4]；自然环境中，氮源和磷源是烃类化合物生物降解的重要因素。鉴此，在矿物润滑油中添加含氮和/或含磷表面活性化合物，可望有效改善其生物降解性，实现润滑油污染环境的“主动”生物修复。迄今为止，有关利用添加剂技术改善矿物润滑油生物降解性的研究鲜有报道。陈波水等[5-12]的研究表明，在矿物基础油、抗磨液压油、高相对分子质量聚α-烯烃等生物难降解润滑油中添加氨基酸、酰胺、磷酸酯等化合物，对改善润滑油的生物降解性作用明显，并提出了“润滑剂生物降解促进剂”的新概念。某些生物降解促进剂还可有效改善润滑油的抗磨减摩性和氧化安定性等性能。

笔者以液体石蜡作为矿物润滑油的模拟基础油，以脂肪酸乙醇胺、脂肪酸酰胺、羟乙基咪唑啉和酰基氧化胺4种含氮表面活性剂作为生物降解促进剂，研究其对液体石蜡生物降解性的影响及促进作用机制。

1 实验部分

1.1 主要试剂及仪器

琼脂粉，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司产品；胰蛋白胨、酵母膏，生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；油酸，分析纯，成都市科龙化工试剂厂产品；液体石蜡，分析纯，上海华灵康复器械厂产品；脂肪酸乙醇胺(FAE)、羟乙基咪唑啉(HIZ)、脂肪酸酰胺(FAA)、酰基氧化胺(AAO)，均由实验室制备。

北京哈科试验仪器厂HARKE-DWK型自动界面张力仪；北京普析通用仪器有限责任公司TU-1950型紫外-可见光分光光度计；金坛市富华仪器有限公司150A型生化培养箱和BS-1E型振荡培养箱。

1.2 菌株及菌悬液

1.2.1 菌株

实验所用菌株分别为假单胞菌属、苍白杆菌属、博德特式菌属和戈登氏菌属。4株菌种系从油污染土壤中富集培养、分离和鉴定，并被证实具有降解润滑油的作用[13]。菌种用含甘油培养物保藏法保存于-70℃备用。

1.2.2 菌悬液

将胰蛋白胨5 g、酵母膏2.5 g、NaCl 5 g 置于500 mL锥形瓶中，用蒸馏水定容至300 mL，121℃蒸汽灭菌20 min，配制得到LB液体培养基。

采用湿重法配制菌悬液作为生物降解实验的接种微生物。将上述4株菌株分别复活于LB平板，挑选单菌落置于LB液体培养基中，于(30±2)℃、转速200 r/min摇床中振荡培养24h。8000 r/min下离心分离6 min，去上层清液，称菌体湿重。用质量分数0.85%无菌生理盐水配制20%菌悬液。量取单菌株菌悬液各2 mL，混合后组成混合菌悬液。

1.3 生物降解性测定

采用文献方法[14-15]测定各受试物的生物降解性。在液体石蜡中分别加入质量分数1.0%的FAE、FAA、HIZ和AAO，配制得到4个加有含氮表面活性剂的液体石蜡试样。以加剂试样、空白试样(液体石蜡)和基准物(油酸)作为受试物，以配制的混合菌悬液作为接种微生物，进行降解实验。实验时间12d、温度(30±2)℃。每隔48h测定并计算受试物CO2生成量，以生物降解指数(BDI)作为降解性指标，评定受试物的生物降解性。BDI定义为相同条件下受试物降解生成的CO2量与基准物油酸降解生成的CO2量的比值，BDI值越大，生物降解性越好。每个受试物分别进行3次重复实验，取3次实验的BDI平均值作为测定结果。

1.4 光密度及油-水界面张力测定

微生物的浓度与光密度成正比，通过测定液体培养物在600 nm波长处的光密度是分析微生物生长变化的常用方法。

将NaCl 0.05 g、NH4NO30.05 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、KCl 0.05 g、CaCl20.25 g、KH2PO40.25 g和K2HPO4·3H2O 2.5 g置于1000 mL锥形瓶中，用蒸馏水定容至 500 mL，121℃蒸汽灭菌 20 min，配制得到pH=7.0 的无机盐培养基。

分别将0.0025 g FAE、0.0025 g FAA、0.0025 g HIZ、0.0025 g AAO和0.25 g液体石蜡及2 mL混合菌悬液加至pH=7.0 的无机盐培养基中，于(30±2)℃、转速200 r/min摇床中振荡培养12 d。培养过程中每隔48 h取样100 mL，采用紫外-可见光分光光度计在600 nm 波长处测定培养液的光密度(OD600)，重复测定3次取平均值。样品液经4000 r/min离心分离10 min后，采用自动界面张力仪测定上层清液的油-水界面张力[16]，重复测定3次取平均值。每次测定结束后，将样品倒回锥形瓶于摇床继续振荡培养。OD600和界面张力测定结果均与不加含氮表面活性剂的空白培养液所得结果对比。

2 结果与讨论

2.1 含氮表面活性剂对液体石蜡生物降解性的影响

图 1为添加质量分数1.0%含氮表面活性剂的液体石蜡式样的生物降解指数(BDI)。从图1可以看出，液体石蜡(LP)加入1.0%含氮表面活性剂后，其BDI明显提高，表明所采用的4种含氮表面活性剂均为有效的生物降解促进剂。在添加量相同的情况下，4种含氮表面活性剂的促进效果差距较大，酰基氧化胺(AAO)的促进效果最好，BDI由加剂前的33.76%提高至72.13%；添加脂肪酸乙醇胺(FAE)、脂肪酸酰胺(FAA)、羟乙基咪唑啉(HIZ)的BDI依次为68.19%、65.95%、57.69%。

图1 添加质量分数1.0%含氮表面活性剂的液体石蜡试样的生物降解指数(BDI)

烃类化合物的生物降解过程是指其被相应的降解菌通过末端氧化生成脂肪醇、脂肪酸，再通过β-氧化形成酰基辅酶A，直至最终被降解的过程[17-18]。其微生物可利用性主要受烃类从不可被微生物利用的非水相到可被微生物利用的水相的传质速率和烃类“暴露”于微生物细胞膜的浓度两个因素的限制[19]。在这4种含氮表面活性剂的作用下，液体石蜡生物降解的这两个因素均得到了强化，生物降解率得到显著提高。酰基氧化胺是一种长链烷基叔胺的氧化物，也是一种易生物降解、性能温和的两性表面活性剂，同等添加量下，其结构中含有的酰基使其具有更为充分的可被微生物利用的氮源。脂肪酸乙醇胺结构中含有亲水性较强的羟基，其亲水性强于脂肪酸酰胺，可使烃类化合物在水中的传质速率加快，生物降解率也就高于脂肪酸酰胺。羟乙基咪唑啉是一种五元含氮杂环化合物，分子结构中虽有羟基和氨基2种亲水基团，但因其正离子特性，容易吸附到带负电的细菌表面，影响细菌的正常生理活动，烃降解酶不能靠近并破坏化合物分子内部结构，也就不能更好地被微生物利用，所以相比其它3种含氮表面活性剂，其促进液体石蜡生物降解的效果较差。

图2为添加质量分数1.0%含氮表面活性剂液体石蜡生物降解中CO2生成量(mCO2)随降解时间(t)的变化。从图2可以看出，纯液体石蜡和加剂液体石蜡生物降解中，CO2生成量随降解时间均呈现波浪型变化，且后者CO2生成量始终多于前者；在第4 d至第6 d之间出现波峰，在第12 d则即将出现波峰。液体石蜡是一种多组分烃类混合物，其中许多成分都可成为微生物生长的碳源，出现2个波峰表明同生菌群在降解中出现了二次生长现象。液体石蜡在生物降解中CO2生成量变化曲线呈现波浪型的原因有两个方面。一方面，降解初期，微生物生长处于适应新环境的迟缓期，活性较低，对碳源消耗不多；降解中期，微生物生长进入对数期和稳定期，碳源被充分消耗利用；降解后期，碳源和无机盐养分被微生物进一步消耗利用，微生物生长进入衰亡期。另一方面，降解过程中，由于含氮表面活性剂增大了水中微生物与液体石蜡的接触几率，提高了微生物对液体石蜡的利用率，进而改善了液体石蜡的生物降解性。添加不同含氮表面活性剂液体石蜡在生物降解中CO2生成量不同的原因与含氮表面活性剂对液体石蜡生物降解指数影响原因相同。

图2 添加质量分数1.0%含氮表面活性剂液体石蜡生物降解中CO2生成量(mCO2)随降解时间(t)的变化

2.2 液体石蜡生物降解过程中体系油-水表面张力变化

图3为添加质量分数1.0%含氮表面活性剂液体石蜡生物降解体系油-水界面张力随降解时间的变化。从图3可以看出，添加含氮表面活性剂的液体石蜡生物降解体系油-水界面张力明显低于不加者，表明4种含氮表面活性剂均能降低体系的油-水界面张力，增大油-水界面面积，使微生物与矿物油的接触机会增多，促进微生物对烃类化合物的吸收利用。这是含氮表面活性剂促进液体石蜡生物降解的原因之一。

图3 液体石蜡生物降解体系油-水界面张力(F)随降解时间(t)的变化

烃类有机物在生物降解中，表面活性剂主要通过乳化作用、提高假相溶解度和增强降解微生物膜的通透性[20]三方面的作用提高其生物可利用性。对烃类化合物的乳化和假增溶作用主要源于表面活性剂能够降低界面的表面张力，并可通过形成胶束的形式将烃类化合物包裹在胶束内部，通过乳化或假增溶方式而脱附进入水相，从而增加烃类化合物的流动性。此外，烃类的难溶性使得摄取烃类的微生物在生长过程中往往伴随着生物表面活性剂的生成。第三方面的作用主要体现在表面活性剂对微生物细胞膜状态的改变。由于生物膜由大量磷脂分子组成，磷脂与生物表面活性剂有类似的结构和性能，所以细胞膜对生物表面活性剂具有较强的吸附作用。正是这种吸附作用影响到烃类化合物的脱附速率，同时改变细胞膜的通透性，使烃类化合物和中间代谢物的跨膜速率加快，有助于提高降解速率。

从图3还可以看出，降解初期，在含氮表面活性剂乳化和提高假相溶解度的作用下，体系油-水界面张力迅速下降，而后略有上升，这可能是因为含氮表面活性剂随碳氢化合物的降解而同时被消耗的结果；在降解第6 d，体系油-水界面张力迅速降低到最低值，这可能是因为随着微生物生长进入稳定期，微生物产生的生物表面活性剂进一步降低了体系的油-水界面张力所致；在降解后期，体系油-水界面张力略有上升，这可能是随着含氮表面活性剂消耗，微生物进入稳定期后期和衰亡期，生物表面活性剂的产生量逐步减少所致。

2.3 液体石蜡生物降解过程中微生物生长变化

图4为液体石蜡生物降解体系的光密度(OD600)随降解时间(t)的变化。由图4可以看出，添加含氮表面活性剂液体石蜡生物降解体系的光密度(微生物浓度)高于不加者，表明4种含氮表面活性剂作为微生物营养物质加速了微生物繁殖，这是其促进液体石蜡生物降解的又一原因。从图4还可以看出，添加含氮表面活性剂液体石蜡生物降解体系在降解第2 d，微生物进入其指数生长期，不加者在降解第4 d 进入指数生长期。这与图3显示的油-水界面张力变化规律相一致。即在降解反应初期，体系的油-水界面张力迅速下降，微生物得以充分利用烃类化合物，并在这一时期加速生长，大量繁殖；此后，随着油-水界面张力的回升，微生物进入稳定生长阶段，可能产生大量乳化剂和生物表面活性剂，从而又一次降低了油-水界面张力，直到微生物进入衰亡期，油-水界面张力回升到一定数值并趋于稳定。

图4 液体石蜡生物降解体系的光密度(OD600)随降解时间(t)的变化

3 结 论

(1)脂肪酸乙醇胺、脂肪酸酰胺、羟乙基咪唑啉、酰基氧化胺4种含氮表面活性剂可显著促进液体石蜡生物降解。在添加量相同的情况下，含氮表面活性剂促进液体石蜡生物降解效果由大到小依次为酰基氧化胺、脂肪酸乙醇胺、脂肪酸酰胺、羟乙基咪唑啉。

(2)含氮表面活性剂在液体石蜡生物降解过程中，可有效降低体系油-水界面张力，使微生物与液体石蜡的接触机会增多，促进微生物对烃类化合物的吸收利用，这是其促进液体石蜡生物降解性的原因之一。含氮表面活性剂作为微生物营养物，在液体石蜡生物降解过程中加速了微生物生长，使微生物数量增多，这是其促进液体石蜡生物降解性的又一原因。

[1] WILLING A. Lubricants based on renewable resources：An environmentally compatible alternative to mineral oil products [J].Chemosphere，2001，43 (1)：89-98.

[2] SOBISCH T, NIEBELSCHüTZ H.Effect of additives on biodegradation of PAH in soils[J].Colloids and Surfaces A： Physico-chemical and Engineering Aspects，2000，162(1)：1-1.

[3] 李秀艳，魏德洲. 氮磷营养盐对微生物降解作用的影响[J].有色金属，2000, 52(4) : 237-239.(LI Xiuyan, WEI Dezhou.Effect of nutrient phosphates and nitrates on biodegradation of microbe[J].Ferrous Metals, 2000, 52(4)：237-239.)

[4] LEE S H，LEE S, KIM D Y.Degradation characteristics of waste lubricants under different nutrient conditions [J].Journal of Hazardous Materials，2007，143(1)：65-72.

[5] 陈波水，方建华, 王九，等.油酰基甘氨酸在矿物润滑油中的生物降解和摩擦磨损特性[J].石油学报(石油加工)，2009，25(增刊1)：6-9.(CHEN Boshui，FANG Jianhua，WANG Jiu, et al.Biodegrdation，friction and wear characteristics of oleoyl glycine in mineral lubrication oil[J].Acta Petrolei Sincia (Petroleum Processing Section)，2009，25(Suppl 1)：6-9.)

[6] CHEN Boshui, WANG Jiu，FANG Jianhua.Tribological performances of fatty acyl amino acids as green additives in lubricating oil[J].China Petroleum Processing & Petrochemical Technology，2010，12 (3)： 49-53.

[7] CHEN Boshui, WANG Jiu，FANG Jianhua.Enhanced biodegradability，lubricity and corrosiveness of lubricating oil by oleic acid diethanolamide phosphate[J].Tribology in Industry，2012，34(3)：152-157.

[8] CHEN Boshui, ZHANG Nan，WU Jiang，et al.Enhanced biodegradability and lubricity of mineral lubricating oil by fatty acidic diethanolamide borates[J].Green Chemistry，2013，15 (3)：738-743.

[9] CHEN Boshui, FANG Jianhua，WU Jiang.The influence of amino Acids on biodegradability，oxidation stability and corrosiveness of lubricating oil[J].Petroleum Science & Technology，2013，31(2)：185-191.

[10] 夏侃，陈波水, 张楠，等.月桂酸二乙醇酰胺对液压油生物降解性及使用性能的影响[J].石油炼制与化工， 2013，44(3)：63-66.(XIA Kan，CHEN Boshui，ZHANG Nan， et al.Effects of lauric diethanolamide on the biodegradability and service performance of hydraulic oil[J].Petroleum Processing and Petrochemicals，2013，44(3)：63-66.)

[11] 夏侃，陈波水, 张楠，等.月桂酸二乙醇酰胺对聚α-烯烃理化性能的影响[J].后勤工程学院学报，2013，29(2)：64-69.(XIA Kan, CHEN Boshui, ZHANG Nan, et al.Effects of lauric diethanolamide on physico-chemical properties of poly-α-olefins[J].Journal of Logistical Engineering University，2013，29(2)：64-69.)

[12] CHEN Boshui, ZHANG Nan，FANG Jianhua，et al.Enhanced biodegradation of petroleum lubricant by bacterial strains harvested from oil contaminated soil[J].Petroleum Science & Technology，2014, 32(8)：938-946.

[13] 张楠，陈波水, 余瑛，等.润滑油降解菌群的构建及其降解性能[J].石油学报(石油加工)，2010，26(增刊1)：182-186.(ZHANG Nan，CHEN Boshui，YU Ying, et al.Construction of bacterial consortium for lubricating oil and it’s biodegradating ability[J].Acta Petrolei Sinica (Petroleum Processing Section)，2010，26(Suppl 1)：182-186.)

[14] 王昆，方建华, 陈波水.润滑油生物降解性快速测定方法的研究[J].石油学报(石油加工)，2004，20(6)：74-78.(WANG Kun，FANG Jianhua，CHEN Boshui.A fast method for evaluating biodegradability of lubricants[J].Acta Petrolei Sinica (Petroleum Processing Section)， 2004，20(6)：74-78.)

[15] WANG Jiu, CHEN Boshui，FANG Jianhua，et al.The influence of environment factors on lubricants biodegradation by orthognal design[J].Advanced Materials Research，2013，772：319-322.

[16] GB/T 22237—2008, 表面活性剂 表面张力的测定[S].

[17] BARATHI S, VASUDEVAN N.Utilization of petroleum hydrocarbons by pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil [J].Environment International，2001，26(5-6)：413-416.

[18] 华兆哲，陈坚, 伦世仪.石油烷烃降解与生物表面活性剂生产的相关性研究及进展[J].石油化工，1998，27(12)：925-929.(HUA Zhaozhe，CHEN Jian，LUN Shiyi.The relativity research progress of the biodegradation of petroleum hydrocarbons and synthesis of biosurfactant[J].Petrochemical Technology，1998，27(12)：925-929.)

[19] 梁生康，王修林, 单宝田.生物表面活性剂强化疏水性有机污染物生物降解研究进展[J].化工环保，2005，25(4)：276-280.(LIANG Shengkang，WANG Xiulin，SHAN Baotian.Development of biosurfactant-enhanced biodegradation of hydrophobic organic pollutants[J].Environmental Protection of Chemical Industry，2005，25 (4):276-280.)

[20] GUHA S, JAFFE P R.Biodegradation kinetics of phenanthrene partitioned into the micellar phase of nonionic surfactants[J].Environmental Science & Technology，1996，30(2)：605-611.

Effect and Mechanism of Nitrogenous Surfactants on Biodegradation of Mineral Lubricating Oil

WEI Youliang1, CHEN Boshui2, WANG Jiu2, ZHANG Nan2, FANG Jianhua2, WU Jiang2

(1.ThePLAof78416Army,Chongqing400054,China;2.DepartmentofOilApplication&ManagementEngineering,LogisticalEngineeringUniversity,Chongqing401311,China)

Impacts of four nitrogenous surfactants, viz. fatty acidic ethanolamine, fatty acidic amide and hydroxyl imidazoline, and acyl amine oxide, as additives on biodegradation of liquid paraffin were tested by a biodegradation tester. Thereafter, the optical density at 600 nm wavelength and oil-water interfacial tension of the biodegradation system were determined by ultraviolet-visible spectrophotometer and interfacial tension instrument, respectively. The results indicated that the biodegradability of liquid paraffin was markedly enhanced by nitrogenous surfactants, among which acyl amine oxide was the best candidate. The biodegradability of liquid paraffin increased from 33.76% to 72.13% after formulated with acyl amine oxide at mass fraction of 1.0%. The stimulation of nitrogenous surfactants to liquid paraffin biodegradation was ascribed to the dramatic decrease of oil-water interfacial tension and the obvious increase of microbial populations in the biodegradation system.

nitrogenous surfactant; mineral lubricating oil; liquid paraffin; biodegradation

2014-06-19

国家自然科学基金项目(50975282)资助

韦友亮，男，硕士研究生，主要从事环境友好添加剂研究；E-mail：18523690127@163.com

陈波水，男，教授，主要从事润滑材料和液体燃料研究；Tel：023-86730832；E-mail：boshuichen@163.com

1001-8719(2015)05-1116-06

TE626.3

A

10.3969/j.issn.1001-8719.2015.05.013