骨肉瘤患者血清miR-21的表达意义及其与化疗药物敏感性的研究

吴子晏，刘洋，杨述华

(1.武汉市第五医院骨科，湖北 武汉 430050；2.武汉协和医院骨科，湖北 武汉 430022)

临床研究

骨肉瘤患者血清miR-21的表达意义及其与化疗药物敏感性的研究

吴子晏1，刘洋1，杨述华2

(1.武汉市第五医院骨科，湖北 武汉 430050；2.武汉协和医院骨科，湖北 武汉 430022)

目的 本研究通过检测骨肉瘤患者血清中miR-21的表达水平，分析其在化疗前后的变化，研究血清miR-21的表达与化疗药物敏感性之间的关系。方法 应用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测38 例骨肉瘤患者(肺部转移患者17 例)化疗前后血清中miR-21的表达水平，分析血清miR-21表达水平与骨肉瘤患者临床病理特征之间以及与化疗药物敏感性之间的关系。结果 与健康对照组表达量0.23相比，血清miR-21在骨肉瘤患者中的表达量为5.68，表达水平明显上调(P=0.007)；有肺部转移的患者血清中miR-21的表达量为7.26，高于无肺部转移的患者表达量2.32，两者之间差异有统计学意义(P=0.023)；血清miR-21与对应肿瘤组织miR-21的表达呈正相关(rho=0.712，P<0.001)；而且本研究发现血清miR-21水平在化疗无效者为7.65，明显高于化疗有效者2.75，两者比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论 高表达的miR-21水平与骨肉瘤肺转移存在一定的关联，血清miR-21表达与骨肉瘤化疗疗效密切相关，其可以作为潜在的生物标记物用于骨肉瘤早期诊断及化疗敏感性预测，且可以作为一个潜在的治疗靶点。

骨肉瘤；血清；miR-21；化疗敏感性

骨肉瘤是一种常见的骨原发恶性肿瘤，好发于青少年，由于其生长快、病程短、易早期发生肺转移，危害性大，死亡率高，随着新型辅助化疗和手术治疗的开展，其5年存活率已经由不超过20%升至60%以上[1]。但由于化疗抵抗的产生和化疗药物的不良反应，骨肉瘤的治疗效果仍不尽人意，目前还缺少一种特异标记物，能用于骨肉瘤早期诊断、预后判断和指导治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 来自华中科技大学协和医院骨科和肿瘤科2012年4月至2014年2月收治的骨肉瘤患者38 例(肺部转移患者17 例)，其中男性24 例，女性14 例，年龄14～62 岁(中位年龄25 岁)。均留取手术前化疗前后1 d空腹血清标本(化疗T12方案，甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂和异环磷酰胺)，肿瘤组织临床分期参照Enneking分期法。全部病例均经临床、X线片、病理组织学检查证实。手术标本用4%的甲醛溶液固定24 h后，按常规石蜡包埋技术进行骨肉瘤石蜡标本的制作，用于病理学观察和miR-21基因检测。健康对照组10 例，男性5 例，女性5 例，年龄在11到30 岁之间，平均年龄19 岁。均取空腹血清标本。

1.2 RNA提取和实时定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)检测miR-21的表达 a)组织和血清总RNA提取：严格按照TaqMan miRNA Isolation Kit(加拿大Applied Biosystems公司)提取分离试剂盒说明书步骤进行，用核酸蛋白分析仪检测提取RNA的浓度和纯度。OD260/OD280均在1.8～2.0。b)miRNA茎环反转录：应用TaqMan microRNA assay和TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(加拿大Applied Biosystems公司)进行逆转录反应，反应条件如下：16℃30 min；42℃30 min；85℃5 min。利用TaqMan Universal PCR Master Mix(加拿大Applied Biosystems公司)进行PCR扩增，反应条件如下：95℃10 min；95℃15s；60℃60s扩增40个循环。采用2-△△Ct公式计算miR-21相对表达量[2]，以U6作为内参基因。

1.3 手术前化疗后肿瘤组织坏死分级[3]Ⅰ级：肿瘤坏死很少或无坏死，坏死小于等于50%；Ⅱ级：肿瘤部分坏死，大于50%但小于90%，偶见疏松纤维组织增生，仍见区域性存活肿瘤；Ⅲ级：绝大部分区域肿瘤坏死，大于等于90%但小于等于99%，仅见散在存活肿瘤细胞灶；Ⅳ级：100%肿瘤坏死，无存活肿瘤细胞，可见纤维组织增生。Ⅰ级和Ⅱ级可认为化疗无效，Ⅲ级和Ⅳ级可认为是化疗有效。

1.4 统计分析 应用SPSS16.0统计软件包对所得的数据进行统计，用Mann-Whitney U检验比较了患者年龄，性别，化疗反应与肿瘤组织和血清miR-21的表达相关性；用Kruskal-Wallis H检验比较了肿瘤位置，Enneking分期与肿瘤组织和血清miR-21的表达相关性，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清miR-21的表达 血清miR-21在骨肉瘤患者和正常对照组中均有表达，在骨肉瘤患者中miR-21的表达量为5.68，而在正常对照组中表达量为0.23，两者差异显著(P<0.001)；且在肺部转移患者血清中miR-21的表达量为7.26，高于无肺部转移患者表达量2.32，两者差异有统计学意义(P=0.023)。

2.2 血清miR-21的表达与患者临床病例特征的关系 骨肉瘤患者血清miR-21的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径和Enneking分期无关(P>0.05)(见表1)；且血清miR-21与对应肿瘤组织miR-21的表达呈正相关(rho=0.712，P<0.001)。

2.3 血清miR-21的表达与疗效的关系 化疗有效组，骨肉瘤患者血清miR-21表达水平由化疗前7.65降至化疗后的3.14，两者差异有统计学意义(P<0.05)；化疗无效组，骨肉瘤患者血清miR-21表达水平由化疗前2.45降至化疗后的1.84，两者无明显变化(P>0.05)；且化疗前化疗有效组血清miR-21表达水平与化疗无效组差异显著(P<0.001)。

表1 miR-21的表达和一般临床病理特征的关系

3 讨 论

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发骨恶性肿瘤，很多患者在确诊时已出现了肺部转移，肺部转移是骨肉瘤患者死亡的一个主要原因，尽管患者5年生存率有明显的改善，但是近20年，即使经过国际诸多研究机构的大量努力，骨肉瘤生存率依然没有明显变化。究其原因骨肉瘤化疗后出现多药耐药是一个主要因素。多药耐药是指肿瘤细胞被一种药物诱发耐药后，同时对其他多种结构和作用机制完全不同的药物产生交叉耐药的一种现象[4]，这是一个多基因参与的复杂过程。癌细胞对化疗药物的敏感性决定了抗癌的有效性。因此，迫切需要寻找理想的肿瘤标志物提高骨肉瘤患者的早期诊断率，监测患者化疗的疗效、实时检测个体化化疗相关标志并据此选择化疗方案。

由于循环中肿瘤细胞、血清和血浆均携带肿瘤组织信息，为实时个体化检测提供了新的检测来源，目前循环miRNA在肿瘤诊断和预后判断方面已显示出卓越性能，如Hu等[5]发现血清miR-486、miR-30 d、miR-1和miR-499表达水平能作为肺癌患者预后的一个强有力指标。

miR-21是miRNAs家族中的一员，其不仅与肿瘤发生有关，还可通过作用于多种肿瘤转移抑制基因影响肿瘤的转移与侵入。Zhu等[6]证实通过减少miR-21的表达而导致TMPI、PDCD4和maspin表达的上调，从而使得乳腺癌NDA-MB-231细胞向肺部转移和侵入的概率明显减少。Wu等[7]发现miR-21在骨肉瘤中高表达，且miR-21通过调控RECK的表达，影响骨肉瘤细胞侵袭和转移。最近研究已表明miR-21的表达和药物耐受有一定的关联。miR-21在乳腺癌阿霉素耐药细胞中高表达，上调或下调miR-21可影响乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性[8]。Li等[9]发现在恶性神经胶质瘤细胞中过表达的miR-21能导致细胞对多种化疗药物产生耐受，而降低miR-21的能增强细胞的敏感性；Hwang等[10]在回顾性研究miR-21和化疗效果及胰腺癌患者预后之间的关系中发现经化疗后miR-21低表达的患者有着更高的无瘤生存率，降低miR-21能提高对化疗药物的敏感性。

本研究检测了38 例骨肉瘤患者及正常对照组血清中的miR-21表达水平，结果显示血清miR-21表达量明显高于对照组，提示外周血miR-21可能是一种较好作为骨肉瘤早期诊断有关的肿瘤标记物；此外，miR-21表达与骨肉瘤患者年龄、性别、部位、大小、TNM分期无统计学相关性，但是有肺部转移患者miR-21的表达水平高于无转移患者，说明miR-21与肿瘤转移之间存在一定的相关性。而肺部转移是骨肉瘤治疗失败和患者死亡的一个重要原因。Yuan等[11]研究也证实血浆miR-21与骨肉瘤患者生存率之间存在明显关联。在肿瘤组织中miR-21的表达和血清中的表达成正相关，提示血清miR-21的表达水平在一定程度上能反映肿瘤组织中的表达水平。而且本研究发现血清miR-21水平在化疗无效者明显低于化疗有效者，两者比较差异有统计学意义，说明血清miR-21水平可能与化疗敏感性相关。Asaga等[12]发现在乳腺癌患者中血清miR-21可以作为一个潜在的诊断和预后指标；Wang等[13]研究证实血清miR-21表达越高的非小细胞肺癌患者有着更高淋巴结转移风险和更短生存期；在前列腺癌中，血清miR-21被发现可以作为多西他赛药物化疗敏感的一个指标[14]。下一步我们将深入探索化疗抵抗的一些具体机制，并联合检测其他相关的一些miR，以期发现更多血清肿瘤分子标记物在骨肉瘤诊断中的作用及与化疗药物敏感性的联系。

综上所述，高表达的miR-21水平与骨肉瘤肺转移存在一定的关联，血清miR-21表达与骨肉瘤化疗疗效密切相关，其可以作为潜在的生物标记物用于骨肉瘤早期诊断及化疗敏感性预测，且可以作为一个潜在的治疗靶点。

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Serum miR-21 Expression and Its Correlation with Chemosensitivity in Osteosarcoma

Wu Ziyan1，Liu Yang1，Yang Shuhua2

(1.Department of Orthopaedics，Fifth Hospital of Wuhan；2.Department of Orthopaedics，Union Hospital of Wuhan，430050，China)

Objective To investigate the correlation between serum miR-21 and chemosensitivity by detecting the expression of serum miR-21 of patients with osteosarcoma and analyze its change before and after chemotherapy.Methods We examed the level of serum miR-21 expression in 38 osteosarcoma patients(17 patients with lung metastasis)before and after chemotherapy by real-time RT-PCR and evaluated the clinical relevance and the correlation between chemosensitivity and miR-21.Results The expression level of serum miR-21 was higher in osteosarcoma patients(5.68)than in healthy people(0.23)(P=0.007)and the expression of miR-21 in lung metastasis patients(7.26)increased obviously compare to non-lung metastasis(2.32)(P=0.023).And the expression of serum miR-21 was closely correlated with corresponding miR-21 mRNA level in osteosarcoma tissues.Moreover，the expression of serum miR-21 was higher in non-effective chemotherapy samples(7.65)than that in effective chemotherapy samples(2.75)(P<0.001).Conclusion High expression of miR-21 correlates with lung metastasis and chemosensitivity in osteosarcoma patients.miR-21 in the peripheral blood may be used to diagnose osteosarcoma early and predict the chemosensitivity as a potential biomarker and miR-21 may be a potential therapeutical target for osteosarcoma patients.

osteosarcoma；serum；miR-21；chernosensitivity

武汉市卫计委课题(WX13C34)

1008-5572(2015)07-0607-04

R73-3

A

2014-12-31

吴子晏(1978- )，男，主治医师，武汉市第五医院骨科，430050。