韧革菌Stereum sp.YM F1.1660的化学成分研究

田梦青，李建芳，李国红

(云南大学云南省生物资源保护与利用重点实验室，云南昆明 650091)

韧革菌Stereum sp.YM F1.1660的化学成分研究

田梦青，李建芳，李国红

(云南大学云南省生物资源保护与利用重点实验室，云南昆明 650091)

对韧革菌属真菌Stereum sp.YMF1.1660发酵液的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及菌丝的甲醇提取物的化学成分进行了研究，从中分离得到6个化合物，经波谱数据分析鉴定为butyl-β-D-glucopyranoside(Ⅰ)、(3，4-dimethoxyphenyl)methanol(Ⅱ)、butyl-β-D-glucofuranoside(Ⅲ)、dibutyl phthalate(Ⅳ)、5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol(Ⅴ)和6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol(Ⅵ)，其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ是首次从韧革菌属真菌中分离得到。

韧革菌;发酵液;菌体;化学成分

韧革菌属真菌主要分布在热带和亚热带地区，生于木屑或埋藏的腐木上。研究表明，该属真菌产生的代谢产物种类丰富、结构多样，包括苯丙呋喃、酚类、酮类以及萜类化合物，尤其能够产生丰富的倍半萜类化合物［1］。其中一些化合物表现出抗菌活性［2］、杀线虫活性［3］、抗氧化活性［4］、抗肿瘤活性［5］等。为了对韧革菌属真菌的化学成分进行比较全面的了解，作者对该属真菌Stereum sp.YMF1.1660发酵液的化学成分进行了研究，并对其结构进行了鉴定。

1 实验

1.1 菌株与培养基

菌株Stereum sp.YMF1.1660，自行保存。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基):马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB培养基):马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

1.2 试剂与仪器

所用有机溶剂均为重蒸工业纯试剂。

Sephadex LH-20型柱层析凝胶，Pharmacia公司; 200～300目柱层析硅胶、薄层层析(TLC)用硅胶G板，青岛海洋化工厂;D101大孔吸附树脂，天津兴南允能高分子技术有限公司;Bruker DRX-500型超导核磁共振仪;Finnigan LCQ-Advantage型质谱仪。

1.3 菌株的发酵及发酵液的浓缩萃取

菌株Stereum sp.YMF1.1660在PDA培养基上活化7 d，待菌丝长满平板、生长旺盛时，将其转接到PDB培养基中［装液量为200 mL·(500 mL三角瓶)-1］，于28℃、180 r·min-1摇床培养5 d。再将活化菌株以5%的接种量接种于PDB培养基中［装液量为250 mL ·(500 mL三角瓶)-1］，共发酵30 L，于28℃、160 r· min-1摇床培养12 d。

经过发酵的培养物，用纱布将菌丝和发酵液分开。发酵液减压浓缩至2 L，用乙酸乙酯和正丁醇分别萃取数次，至萃取相中无明显颜色为止，再将萃取物用旋转蒸发仪在50℃下浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物1.1660A(1.9 g)、正丁醇萃取物1.1660B(34.59 g)。菌丝在45℃烘箱中烘干，再用甲醇浸泡提取，得到甲醇提取物1.1660C(5.35 g)。

1.4 菌株发酵液乙酸乙酯萃取部分的分离

将1.9 g乙酸乙酯萃取物1.1660A上甲醇凝胶柱，得到6个组分(A1～A6)。

将组分A4(672 mg)上甲醇凝胶(70 g)柱，流速控制在每滴8～9 s，得到4个组分(A4-1～A4-4)。其中组分A4-2(357 mg)用等量硅胶拌样，自然风干，二氯甲烷及硅胶装柱，干法上样，用体积比为100∶1、50∶1的二氯甲烷-丙酮依次梯度洗脱，根据薄层层析展板、显色合并相同馏分，得到3个组分(A4-2-1～A4-2-3)。其中组分A4-2-1(70 mg)上甲醇凝胶(40 g)柱得到2个组分(A4-2-1-1～A4-2-1-2)。将组分A4-2-1-1用等量硅胶拌样，自然风干，三氯甲烷及硅胶装柱，干法上样，用纯三氯甲烷洗脱，得到化合物Ⅰ(7 mg)。

将组分A5(840 mg)上甲醇凝胶柱得到3个组分(A5-1～A5-3)。其中A5-1(330 mg)用甲醇溶解后用硅胶拌样，二氯甲烷及硅胶装柱，干法上样，用体积比为400∶1、300∶1、200∶1、50∶1、10∶1、2∶1、0∶1的二氯甲烷-丙酮依次梯度洗脱，根据薄层层析展板、显色合并相同馏分，得到化合物Ⅱ(6 mg)。

1.5 菌株发酵液正丁醇萃取部分的分离

将34.59 g正丁醇萃取物1.1660B用D101大孔吸附树脂柱层析，用体积比为0∶1、30∶1、60∶1、100∶1的乙醇-水依次梯度洗脱，得到4个组分(B1～B4)。

将组分B2(1.24 mg)上甲醇凝胶(140 mg)柱，流速控制在每滴8～9 s，得到3个组分(B2-1～B2-3)。其中组分B2-2(645 mg)用等量硅胶拌样，自然风干，乙酸乙酯及硅胶装柱，干法上样，用体积比为100∶1、80∶1、50∶1、20∶1的乙酸乙酯-甲醇依次梯度洗脱，得到4个组分(B2-2-1～B2-2-4)。将组分B2-2-2用等量硅胶拌样，自然风干，石油醚及硅胶装柱，干法上样，用体积比为300∶1、200∶1、100∶1、50∶1的石油醚-丙酮依次梯度洗脱，得到化合物Ⅲ(5 mg)。将组分B2-2-3(71 mg)用等量硅胶拌样，自然风干，石油醚及硅胶装柱，干法上样，用体积比为80∶1、50∶1、20∶1、10∶1的石油醚-丙酮依次梯度洗脱，得到化合物Ⅳ(5 mg)。

1.6 菌丝甲醇提取部分的分离

将5.35 g甲醇提取物1.1660C用甲醇溶解，等量硅胶拌样，自然风干，石油醚及硅胶装柱，干法上样，用体积比为100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1的石油醚-丙酮依次梯度洗脱，根据薄层层析展板、显色合并相同馏分，得到10个组分(C1～C10)。

将组分C4(53 mg)重复上2次丙酮凝胶(70 g)柱，流速控制在每滴8～9 s，得到3个组分(C4-1～C4-3)。其中组分C4-2(40 mg)用等量硅胶拌样，自然风干，石油醚及硅胶装柱，干法上样，用体积比为50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1的石油醚-丙酮依次洗脱，得到4个组分(C4-2-1～C4-2-4)，将组分C4-2-2(8.5 mg)上丙酮凝胶(20 g)柱，分离得到化合物Ⅴ(4 mg)。

将组分C7(120 mg)上甲醇凝胶(70 g)柱，流速控制在每滴8～9 s，分离得到3个组分(C7-1～C7-3)。其中组分C7-2(80 mg)用等量硅胶拌样，自然风干，石油醚及硅胶装柱，干法上样，用体积比为30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1的石油醚-丙酮依次洗脱，分离得到化合物Ⅵ(12 mg)。

2 结果与讨论

2.1 化合物Ⅰ～Ⅵ的结构表征

化合物Ⅰ:无色油状物;ESI-MS，m/z:237［M+ H］+;1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ:4.27(1H，d，J= 7.8 Hz)，3.87～3.95(2H，m)，3.70(1H，m)，3.58 (1H，m)，3.26～3.38(3H，m)，3.20(1H，m)，1.65 (2H，m)，1.45(2H，m)，0.98(3H，t，J=7.6 Hz);13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ:71.0(t，C-1)，33.3(t，C-2)，20.6(t，C-3)，14.6(q，C-4)，104.8(d，C-1')，75.6(d，C-2')，78.6(d，C-3')，72.1(d，C-4')，78.3(d，C-5')，63.3(t，C-6')。与文献［6］报道的化合物数据相比较，确定化合物Ⅰ为butyl-β-D-glucopyranoside。

化合物Ⅱ:黄色油状物;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ:3.90(3H，s，MeO)，3.88(3H，s，MeO)，4.62 (2H，s，H-7)，6.86(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.93(1H，s，H-2);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:56.4(MeO)，56.3(MeO)，65.7(C-7)，111.0(C-5)，111.6(C-2)，129.8(C-6)，134.0(C-1)，149.1(C-4)，149.6(C-3)。与文献［7］报道的化合物数据相比较，确定化合物Ⅱ为(3，4-dimethoxyphenyl)methanol。

化合物Ⅲ:无色油状物;ESI-MS，m/z:237［M+ H］+;1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ:4.84(1H，m，overlap with water)，4.00(1H，m)，3.89～3.93(2H，m)，3.69～3.72(2H，m)，3.60～3.62(2H，m)，3.41(1H，m)，3.31(1H，m)，1.58(2H，t，J=5.8 Hz)，1.40(2H，q，J=7.6 Hz)，0.95(3H，t，J=7.4 Hz);13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ:109.8(d，C-1')，84.7(d，C-4')，83.8 (d，C-2')，79.2(d，C-3')，72.3(d，C-5')，69.0(t，C-1)，65.0(t，C-6')，33.3(t，C-2)，20.7(t，C-3)，14.6 (q，C-4)。与文献［6］报道的化合物数据相比较，确定化合物Ⅲ为butyl-β-D-glucofuranoside。

化合物Ⅳ:无色油状物;ESI-MS，m/z:579［2M+ Na］+，279［M+H］+;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ: 7.71(2H，m)，7.52(2H，m)，4.30(4H，t，J=6.8 Hz)，1.73(4H，tt，J=7.1 Hz)，1.47(4H，qq，J=7.5 Hz)，0.96(6H，t，J=7.5 Hz);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:168.0(C-7)，132.7(C-1/2)，131.3(C-3/4)，129.2(C-5/6)，65.9(C-1'/1'')，31.0(C-2'/2'')，19.6(C-3'/3'')，14.1(C-4'/4'')。与文献［8］报道的化合物数据相比较，确定化合物Ⅳ为dibutyl phthalate。

化合物Ⅴ:无色固体;ESI-MS，m/z:429［M+ H］+;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ:6.53(1H，d，J= 8.4 Hz)，6.26(1H，d，J=8.5 Hz)，5.26(2H，m)，3.76 (1H，m)，1.01(3H，d，J=5.8 Hz)，0.94(3H，d，J= 6.7 Hz)，0.91(3H，s)，0.89(3H，d，J=6.7 Hz)，0.84 (3H，s)，0.83(3H，d，J=6.7 Hz);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:30.8(C-1)，35.0(C-2)，67.0(C-3)，39.9 (C-4)，83.4(C-5)，136.8(C-6 or C-22)，131.7(C-7)，80.7(C-8)，51.5(C-9)，37.5(C-10)，21.4(C-11)，37.8(C-12)，45.3(C-13)，52.1(C-14)，24.0(C-15)，29.1(C-16)，57.6(C-17)，13.1(C-18)，18.2(C-19)，40.3(C-20)，136.8(C-22 or C-6)，133.5(C-23)，44.3 (C-24)，34.4(C-25)，20.1(C-26)，20.4(C-27)，18.3 (C-28)。与文献［9］报道的化合物数据相比较，确定化合物Ⅴ为5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol。

化合物Ⅵ:白色针状结晶;ESI-MS，m/z:413［M+ 1］+;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ:0.60(3H，s)，0.83 (3H，d，J=6.5 Hz)，0.84(3H，d，J=6.5 Hz)，0.92 (3H，d，J=6.8 Hz)，1.02(3H，d，J=6.6 Hz)，1.08 (3H，s)，5.19(1H，dd，J=15.2 Hz，8.0 Hz)，5.23 (1H，dd，J=15.2 Hz，7.2 Hz)，4.07(1H，m)，3.63 (1H，m)，5.32(1H，brs);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:144.4(C-8)，135.8(C-22)，132.6(C-23)，118.0(C-7)，76.4(C-9)，74.1(C-6)，68.1(C-3)，56.4(C-17)，55.2(C-14)，44.2(C-10)，43.8(C-13)，43.2(C-24)，40.8(C-20)，39.9(C-4)，39.7(C-12)，37.6(C-5)，33.5(C-25)，31.3(C-1)，30.9(C-2)，28.3(C-16)，23.3(C-11)，22.5(C-15)，21.5(C-21)，21.2(C-21)，20.3(C-27)，20.0(C-26)，19.2(C-19)，17.6(C-28)，12.5(C-18)。与文献［10］报道的化合物数据相比较，确定化合物Ⅵ为6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol。

2.2 化合物Ⅰ～Ⅵ的结构式及生物活性

化合物Ⅰ～Ⅵ的结构式见图1。

图1 化合物Ⅰ～Ⅵ的结构式Fig.1 Structural formu la of com poundⅠ～Ⅵ

化合物Ⅰ(butyl-β-D-glucopyranoside)和化合物Ⅲ(butyl-β-D-glucofuranoside)是文献［6］报道的人工合成化合物，首次在韧革菌属(Stereum)真菌中分离得到。化合物Ⅱ［(3，4-dimethoxyphenyl)methanol］是Kanho等［7］用牵牛属 (Pharbitisnil)的根对苯甲醛类(benzaldehyde-type)和乙酰苯类(acetophenone-type)衍生物进行生物转化得到的，未报道其生物活性，其生物活性的筛选有待进一步研究。化合物Ⅳ(dibutyl phthalate)是Savard等［11］从青霉菌属菌株 Penicillium bilaii PB-50中分离得到的，可显著提高乳腺上皮细胞的增殖和泌乳能力［12］，此化合物也是首次在韧革菌属(Stereum)真菌中分离得到。韩珊等［13］研究发现，化合物Ⅳ会导致板栗幼苗枯萎。化合物Ⅴ(5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol)是真菌中普遍存在的化合物。化合物Ⅵ(6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol)是陈晓梅等［10］从石斛小菇菌丝体的甲醇提取物中分离得到的，在韧革菌属(Stereum)真菌中首次分离得到。

对所分离到的6种化合物进行杀线虫实验，结果表明，6种化合物均无杀线虫活性。

3 结论

从韧革菌属真菌Stereum sp.YMF1.1660发酵液的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及菌丝的甲醇提取物中分离得到6个化合物:butyl-β-D-glucopyranoside(Ⅰ)、(3，4-dimethoxyphenyl)methanol(Ⅱ)、butyl-β-D-glucofuranoside(Ⅲ)、dibutyl phthalate(Ⅳ)、5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol(Ⅴ)和6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol(Ⅵ)，其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ是首次从韧革菌属真菌中分离得到。

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Study on Chem ical Constituents of Stereum sp.YMF1.1660

TIAN M eng-qing，LI Jian-fang，LIGuo-hong
(Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resource，Yunnan University，Kunming 650091，China)

The chemical constituents of Stereum sp.YMF1.1660 were investigated.Six compounds including butyl-β-D-glucopyranoside(Ⅰ)，(3，4-dimethoxyphenyl)methanol(Ⅱ)，butyl-β-D-glucofuranoside(Ⅲ)，dibutyl phthalate (Ⅳ)，5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol(Ⅴ)and 6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol(Ⅵ)were isolated from its ethyl acetate and n-butanol extract of broth and methanol extract ofmycelia.And the compoundsⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ andⅥwere first isolated from Stereum sp..Their structureswere characterized and confirmed by spectroscopy analysis.

Stereum sp.;broth;mycelia;chemical constituents

R 284.1

A

1672-5425(2015)02-0029-04

版权声明

《化学与生物工程》编辑部

10.3969/j.issn.1672-5425.2015.02.007

国家973计划项目(2013CB127505)，云南省自然科学基金资助项目(2013FB003)

2014-11-19

田梦青(1991-)，女，云南大姚人，硕士研究生，研究方向:微生物次生代谢产物，E-mail:793138039@qq.com;通讯作者:

李国红，副研究员，E-mail:ligh@ynu.edu.cn。

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