奥拉西坦对新生大鼠脑损伤中NT-3蛋白的相关研究①

杨 松，王一川，穆国军

(佳木斯大学附属第一医院儿内一科，黑龙江 佳木斯 154003)

奥拉西坦对新生大鼠脑损伤中NT-3蛋白的相关研究①

杨 松，王一川，穆国军

(佳木斯大学附属第一医院儿内一科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：制备HIBD模型，应用神经细胞营养剂—奥拉西坦，探讨其对神经再生、修复及其可能的机制，同时观察HIBD后神经营养素-3(NT-3)的动态变化。方法：经乙醚麻醉新生7日Wistar大鼠(相当于人类新生儿期)后，于颈部正中切口，分离结扎左侧颈总动脉，动物休息静止2h，放入含有8%氧气和92%氮气的密闭容器持续2h，制备成HIE模型。将缺血缺氧后出现左旋或夹尾左旋者纳入试验。随机共分为3组，雌雄不限，体重在13～15g，每组25只。(1)空白组:分离左侧颈总动脉后下置线，不结扎，不缺氧。(2)模型组: 制备大鼠缺血缺氧性脑损伤模型后立即腹腔注射生理盐水0.1mL/只。(3)治疗组: 造模成功后立即腹腔注ORS 100mg/kg。所有动物于6h，12h，24d，36h，后断头取脑，通过免疫组化方法检测各时间点NT-3的表达情况。结果：通过免疫组化分析各组比较，可见治疗组NT-3表达最多，模型组表达次之，空白组表达最少，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：证明奥拉西坦的神经保护作用及NT-3在新生儿缺氧缺血性脑损伤中发挥重要的作用。

新生儿缺氧缺血性脑损伤；奥拉西坦；NT-3

新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)是围产期新生儿窒息导致的缺氧缺血性脑损害，其病死率高同时也是我国小儿致残的主要原因[1～2]。随着新生儿重症监护病房(NICU)对HIBD抢救的存活率提高，但其存活者中如智力障碍、神经行为异常、脑性瘫痪、癫痫等神经系统后遗症也随之升高[1]。而神经营养因子是能促进神经元存活，诱导其增殖分化，并对神经系统的发育及功能的维持起一定作用,从而减少神经系统后遗症的发生，降低了HIBD致残率，故成为了目前研究的热点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级Wistar新生大鼠100只，雌雄不限，出生后7d(相当于人类新生儿期)。佳木斯大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂

奥拉西坦溶液(100mg/kg)，NT-3抗体(Sigma美国)。

1.3 制备动物模型

经乙醚麻醉后，取颈部正中切口，分开结扎左颈总动脉，放入含有8%氮气和92%氧气的密闭容器持续2h，制备成HIE模型。将出现左旋或夹尾左旋者纳入试验。

1.4 实验分组及给药

出生7d大鼠共分为3组，每组25只。正常组:分离左侧颈总动脉后在动脉下置线, 结扎亦不低氧。模型组: 制备大鼠HIE模型立即腹腔注射生理盐水0.1mL/只。治疗组: 模型后立即腹腔注射ORS 100 mg/kg，即6h，12h，24d，36h，在HIE后即刻给药一次，之后每24小时给药一次。

1.5 样品处理

按照不同时间点处死各组动物，大鼠经拉颈处死后迅速于冰上开颅分离脑组织，按不同检测目的分别储存大脑及部分脑干脊髓组织。

1.6 检测

免疫组化。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计分析软件进行分析，以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行两两比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

免疫组化检查结果：空白组：可见NT-3有微量表达，各组间无统计学意义(P>0.05)。模型组：NT-3阳性细胞在造模6h出现表达，12开始下降，24降到最低，此后逐渐升高。模型组与空白组SDF-1阳性细胞数比较显著，差异有统计学意义(P<0.01)。治疗组各时间点NT-3的表达均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；模型组和治疗组阳性细胞数明显多于空白组，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 NT-3蛋白免疫组化结果

4 讨论

缺氧缺血性脑损伤后的微环境中存在多种抑制轴突再生、分化的抑制分子[3]。目前，如何克服缺氧缺血性脑损伤后抑制轴突再生的微环境，促进轴突再生并与靶细胞形成功能性突触联系是缺氧缺血性脑损伤修复的目标，也是缺氧缺血性脑损伤患者功能恢复的基础。国内外研究证实[4，5]，在缺氧缺血性脑损伤后的有害微环境中，存在许多生长抑制分子和轴突排斥分子，如突起坍塌蛋白家族、坍塌反应调节蛋白家族、髓鞘相关的抑制分子、轴突引导分子等。这些抑制分子主要通过 Rho-ROCK II 信号途径及细胞极性信号途径传递抑制信号，作用于轴突生长锥的细胞骨架，介导了脊髓损伤、脑出血、缺血性脑损伤等轴突的再生性抑制。有学者研究证明，对缺血性脑损伤大鼠海马和纹状体NT-3 mRNA 表达的影响中提到，缺血性脑损伤24h 和36h 后模型组动物的NT-3 mRNA 在海马和纹状体均有表达增多。Yang 等研究报道，用核酶保护和原位杂交法检测短暂性脑缺血大鼠海马神经元时发现NT-3的表达趋势是呈先下降后上升的趋势。本实验通过结扎7d龄新生鼠左侧颈总动脉及缺氧处理后，用免疫组化法检测NT-3蛋白的表达，分别采用6h，12h，24d，36h，本实验结果显示模型组NT-3蛋白在大脑皮质、海马神经细胞胞及轴突内均有阳性表达。6h就有少量表达，12h表达下降，24h表达最低，以后逐渐升高，与上述实验结果基本一致。综上所述，神经细胞营养剂可通过促进NT-3的表达起到营养神经的作用。因此，对于大脑神元损伤、修复和再生的机制，可以通过对缺氧缺血后脑损伤中 NT-3 的动态变化的研究，为临床治疗缺氧缺血性脑损伤提供新的思路，使得与NT-3有关的药物治疗可能成为中枢神经系统损伤修复新的有效手段。

[1]彭形.神经生长因子生物学效应的研究进展[J].检验医学与临床， 2009，6(3):203-204

[2]路露，陈美婉，罗焕敏.神经营养因子受体的研究进展[J] . 中国老年医学杂志，2010，30:126-131

[3]张燕平. 神经生长因子对脑梗死大鼠的神经保护作用[J] .中国现代医生， 2010，48(1):7

[4]李平法，李生莹，闫福林，等.Lactuside B 对缺血性脑损伤大鼠海马和纹状体NT-3 mRNA 表达的影响[J].中风与神经疾病杂志，2011，28(11):968-971

[5]Yang JT，Chang CN，Lee TH， et al． Effect of dexamethasone on the expression of brain-derived neurotrophin factor and neurotropuin-3 messenger ribonucleic acid after forebrain ischemia in the rat[J]．Crit Care Med，2002， 30(4) : 913-918

[6]顾镜月，邵巍.Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔对NF200在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中表达的影响[J].黑龙江医药科学，2014，37(1):5-6

杨松(1981～)女，黑龙江佳木斯人，学士，医师。 通迅作者：穆国军(1983～)男，吉林四平人，在读硕士研究生。E-mail:Muguojw2008@163.com。

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1008-0104(2015)01-0145-01

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