骨髓单个核细胞移植对大鼠脊髓全横断损伤后髓鞘碱性蛋白表达影响①

季庆辉，申福国，孔维丽，杨建华，崔宏宇，乔建民

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

骨髓单个核细胞移植对大鼠脊髓全横断损伤后髓鞘碱性蛋白表达影响①

季庆辉，申福国，孔维丽，杨建华，崔宏宇，乔建民

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探讨同种异体骨髓单个核细胞(BMMNCs)移植对脊髓全横断损伤区局部微环境中髓鞘碱性蛋白表达的影响。方法：取8 周龄Wistar大鼠45只，雌雄不限、每只体重200～220g，随机分为3组:实验组(n=15)、对照组(n=15)、假手术组(n=15)。对实验组和对照组大鼠建立脊髓全横断损伤动物模型。实验组造模后对脊髓横断处上下两端立即注入骨髓单个核细胞；对照组对脊髓横断处上下两端注入磷酸盐缓冲液(PBS)；假手术组不损伤脊髓，仅剪除T8～10棘突和椎板后逐层缝合。于细胞移植后的1d，5d,1w,2w，4w 和6w分别行BBB大鼠后肢功能评估来判断脊髓神经功能恢复情况，并采用免疫组织化学检测观察大鼠脊髓髓鞘碱性蛋白的表达。结果：(1)BBB评分结果显示各时间点假手术组均为正常范围，实验组和对照组分值随时间均逐渐增加，且实验组较对照组高(P<0.05)，但均未达到正常组水平，术后4周实验组BBB评分较对照组增加显著，差异有统计学意义(P<0.05)；(2)免疫组织染色结果显示各时间点实验组和对照组大鼠脊髓中髓鞘碱性蛋白的表达量高于假手术组，且实验组高于对照组(P<0.05)。结论：同种异体的骨髓单个核细胞移植可能改变了局部的微环境并上调了脊髓内髓鞘碱性蛋白的表达。

骨髓单个核细胞；细胞移植；脊髓横断损伤；髓鞘碱性蛋白

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是全球公认的给患者及家庭带来巨大伤害的疾病之一。因其发病率高、损伤具有不可逆性改变、治愈率低、截瘫率高，给患者及家庭带来巨大的心里压力和经济上的负担。脊髓功能的恢复仍是目前面临的巨大难题，然而动物实验已经证实骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BMMNCs)的移植对脊髓损伤的治疗取得了一定的效果[1,2]。本实验通过BMMNCs移植脊髓全横断模型大鼠，观察对大鼠后肢功能及受损脊髓组织微环境中髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)变化，初步探讨骨髓单个核细胞对治疗全横断脊髓大鼠神经功能恢复的分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及其分组

取45只8周龄Wistar大鼠(清洁级，由大连实验动物中心提供)，体重200～220g，雌雄不限。按照随机数表法随机分为:实验组(n=15)、对照组(n=15)、假手术组(n=15)。实验中对动物的处置符合我国相关伦理学规定[3]。动物在(23±2)℃饲养室饲养。

1.2 实验主要试剂和仪器

SABC试剂盒，MBP克隆抗体，BSA封闭液 (武汉博士得)；DAB显色系统(北京中杉金桥)；恒温冰冻切片机CM1900(德国LEICA)；台式离心机(美国Sigma)。

1.3 骨髓单个核细胞的分离、纯化

大鼠用10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，碘伏、酒精溶液常规消毒。切除大鼠股骨、胫骨，用5%肝素生理盐水混合液冲洗骨髓腔, 将悬浮液进行1500r/min、离心10min，弃去上清液。用2mL PBS稀释，放置在含有2mL淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min、离心20min，吸取白色界面层, 用2mL的PBS洗涤两次，离心10min、1000r/min。由此得到的悬液保存在DMEM培养基中，并将细胞浓度调节到6×108mL-1。台盼蓝检测细胞活性在90%以上，4℃保存，2h内移植。

1.4 脊髓损伤动物模型的制作及骨髓单个核细胞细胞移植

参照杨建华[4]脊髓全横断模型建模：将实验组和对照组大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛0.3mL/100g)成功后固定于无菌操作台，定位T9脊髓棘突并作标记，术区常规消毒3遍，在标记上下行正中切口长约2.0，使椎骨暴露，咬除相应棘突、椎板，借助显微外科剪在T9节段打开椎管，直至完全暴露脊髓组织，用自制脊髓横断刀(取剃须刀片刀刃部长约3cm宽约0.5cm)迅速、轻柔、完全离断脊髓，大量生理盐水冲洗，逐层缝合，常规消毒，脊髓损伤模型制备完成。术后给予腹腔内青霉素注射防感染，早晚挤压、按摩腹腔辅助排便、排尿。

实验组造模过程中在脊髓横断处上下两端各注射15μL 浓度为6×108L-1的BMMNCs悬液；对照组造模过程中在脊髓横断处上下两端各注射15μL PBS缓冲液；假手术组只咬除对应的棘突、椎板，不损伤脊髓，然后逐层缝合。

1.5 运动功能评估

各组动物分别在SCI后1d、5d、1w、2w、4w和6w后，随机每组抽取5只大鼠进行BBB评分。为避免对实验结果影响，每次评分前都会协助大鼠排空尿液、粪便，并且分别由两人同时独立进行BBB评分。参照BBB评分[5]项目表，仔细观察大鼠双侧后肢的运动功能并分别对大鼠的左、右后肢进行运动功能评分。每只大鼠严格按照标准评分3次，最后取其平均值。

1.6 组织学和免疫组化分析

到达各时间点后处死大鼠，取材、切片常规脱蜡水化、3% H2O2处理，微波修复抗原，分别滴加一抗：兔抗鼠髓鞘碱性蛋白多克隆抗体，4℃过夜后分别滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37℃孵育30min，加SABC工作液，DAB显色，苏木素染色，封片观察。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 功能评估

2.1.1 术后动物一般情况

所有大鼠均能耐受手术，手术后前几天饮水及进食食物较少，此后饮食逐渐恢复至正常水平。术后出现切口感染1例，未见血尿、下肢溃疡等并发症出现，偶尔可见术后大鼠间的相互攻击。术后积极防治并发症，感染的大鼠给予加大青霉素剂量及术后感染切口每日换药；术后尿潴留大鼠，每天早晚各一次按摩、挤压膀胱协助排尿，直至完全恢复；术后死亡1例。

2.1.2 脊髓神经功能评价

参照BBB评分[5]标准要求严格进行评分，所有大鼠均在实验前进行BBB双后肢运动功能评分，且全为满分21分，均符合实验要求。实验组和对照组大鼠在脊髓全横断术后1d双侧后肢运动功能均完全丧失，双侧下肢均呈拖行状态，5d后双侧下肢的运动功能开始逐渐恢复，但是各组未见明显的差异；2w后实验组和对照组出现了轻微的髋、膝关节主动运动，但是实验组评分结果较对照组稍高但差别不具有统计学意义(P>0.05)；4W后上述两组出现了髋、膝关节明显的主动运动，踝关节轻微运动，实验组较对照评分结果高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

时间组别 1d5d1w2w4w6w假手术组21.00±0.0021.00±0.0021.00±0.0021.00±0.0021.00±0.0021.00±0.00对照组0.00±0.000.15±0.781.62±0.40a2.10±0.10a3.30±0.58a4.25±0.31a实验组0.00±0.001.90±0.743.90±0.49ab5.80±0.69ab7.23±0.58ab8.10±0.50ab

注：与假手术组比较，aP<0.05；与对照组比较，bP<0.01。

2.2 组织学和免疫组化染色结果

MBP蛋白免疫组织化学染色(图1～3)发现，4周后在实验组脊髓损伤处发现有些细胞的核呈棕紫色阳性，对照组呈棕色的细胞明显少或无，表明移植的骨髓单个核细胞在宿主体内已有向髓鞘细胞方向分化的趋势，实验组在BMMNCs治疗作用下脱髓鞘的轴突髓鞘再生明显。

图1～3：1假手术组、2实验组、3对照组，术后4周MBP免疫组织化学染色(×400)

3 讨论

近些年来有关干细胞移植的方法来治疗急性脊髓损伤修复的研究一直是神经-生物科学领域的热点，倍受基础和临床科研工作者的青睐。目前大量动物实验研究均已经证实BMMNCs[2]能对脊髓损伤有一定的修复作用。BMMNCs因提取简单而且不必进行培养非常适合进行移植治疗，为大鼠移植治疗SCI提供新的种子细胞。BMMNCs具有自我更新、分化的潜能，并且还能释放某些细胞因子促进神经和血管再生[6,7]，并促进脊髓功能的恢复，然而在体内恢复机制很复杂，目前仍不明确。

本实验通过BMMNCs移植并观察脊髓损伤区附近微环境中髓鞘碱性蛋白表达，免疫组织化结果均表明受损伤大鼠脊髓的神经功能恢复与髓鞘碱性蛋白表达有一定的相关性。

脊髓组织损伤后可使损伤组织分泌相应的神经化学物质、增加了微血管通透性和周围组织的水肿等一系列的病理生理改变，这种病理生理变化必然导致损伤后脊髓组织自身成分的改变，这其中也包括中枢神经系统(CNS)中髓鞘的主要组成成分-髓鞘碱性蛋白(MBP)变化。MBP是CNS髓鞘的主要结构蛋白[8]，是维持神经元髓鞘结构和功能稳定的重要物质基础，其主要生理功能是通过与髓鞘膜带负电荷的磷脂在髓鞘浆膜面的相互作用，促使少突胶质细胞质面融合而成多层膜结构的主要致密线维持鞘的紧密性，而且在髓鞘形成过程中具有启动作用。Olesson Y[9]等研究发现在大鼠脊髓损伤模型中通过免疫组织化学的方法观察到在脊髓损伤组织中许多神经细胞体皱缩并且组织呈海绵状水肿表现, 其内存在一个胶质细胞原纤维酸性蛋白免疫应答的显著增加和MBP染色的明显减少，其丢失的髓鞘碱性蛋白进入脑脊液中,脊髓损伤后损伤部位的缺血及炎症和免疫反应可导致血脊髓屏障的破坏,使其毛细血管内皮细胞间隙增宽,血管壁连接松散,血脊髓屏障的通透性增加, 此破坏并不局限于损伤部位且向损伤部位的周边区域扩散[10]。

在本实验研究中，移植BMMNCs的大鼠后肢运动功能从2周起明显优于对照组。第6周后的大鼠的HE染色显示明显愈合和组织形态修复完好。用髓鞘碱性蛋白免疫组化显示阳性髓鞘细胞增多及部分运动神经元中突触蛋白光密度增加。并且实验组的BBB评分中明显优于对照组，且有大量的髓鞘阳性细胞个数增加，可能是促进内源性修复机制之一，这种机制与BMMNCs的移植呈高度相关性。本实验通过组织学和免疫组化检测等方法，发现BMMNCs能在脊髓损伤环境中存活，6周后依然能够检测到，而且有效促进了截瘫的大鼠后肢功能恢复。并且发现，在宿主存活的单个核细胞不仅促进了髓鞘的修复，而且提高的髓鞘细胞的量随周期的延长有逐渐增加的趋势，6周时增加的量与对照组相比有统计学差异。脊髓损伤的恢复行为学测试表明实验组的后肢运动功能较对照组大鼠恢复明显，所有大鼠在脊髓损伤前BBB评分为21，术后1d～6w每个时间点BBB评分移植组均高于对照组。骨髓单个核细胞移植能促进大鼠的后肢运动功能恢复，于Chopp[11]等研究发现移植人MSC细胞相似。另外本研究结果发现, BMMNCs移植后6周的行为学观察，实验组和对照组大鼠的后肢功能均有所改善，但前者明显比后者好。这一现象说明BMMNCs移植入大鼠脊髓损伤处可以促进损伤脊髓的修复和再生。这与文献报道的其他各种干细胞(神经、胚胎和骨髓干细胞)治疗脊髓损伤相似[12～14]，说明植入细胞能融入血管结构并长期存活体内促进再生血管，而且基本适应机体内的微环境，并能分泌相关细胞因子，来继续促进损伤脊髓功能的恢复，防止继发性脊髓损伤的可能。

脊髓损伤后神经元再生和重塑是一个十分复杂的课题。本研究从动物行为学和组织形态MBP含量这两个方面显示了BMMNCs可促进脊髓全横断损伤后髓鞘细胞的再生、上调了髓鞘碱性蛋白的表达，这可能是 BMMNCs促进大鼠后肢功能改变的原因。在本实验中未进行PCR检测和western blot检测，至于BMMNCs是否通过刺激 MBP 基因的转录或其他机制来促进 MBP 的合成还有待进一步研究。

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The effect of bone marrow mononuclear cells transplantation on the expression of myelin basic proteinafter acute transection spinal cord injury in rats

JIQing-hui，SHENFu-guo,KONGWei-li,YANGJian-hua,CUIHong-yu,QIAOJian-min

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Objective: To investigate the effects of the transplantation of allogeneic bone marrow mononuclear cells (BMMNCs) on myelin basic protein expression in spinal cord injury district local microenvironment. Methods: 45 Winstar rats of either gender aged 8 weeks old, each weighing from 200 to 220g, were randomly divided into three groups: the experimental group (n=15), the control group (n=15), the sham group (n=15). Rats in the experimental and control groups were established spinal cord injury model. After modeling rats in experimental group were immediately injected into the bone marrow mononuclear cells at the upper and lower ends of the spinal cord. Rats in the control group were injected phosphate buffer (PBS) at the upper and lower ends of the spinal cord. The spinal cords in sham group were not damaged. The spines were cut off only T8-10 sutured after the sudden and lamina.After the cells were transplanted, BBB hindlimb function in rats was assessed in 1d, 5d, 1w, 2w, 4w and 6w to determine the recovery of neurological function. Immunohistochemical expression method was used to observe rat spinal cord myelin basic protein. Results: (1) BBB scores showed rats in sham group at each time point were in normal range. Scores in the experimental group and control group were gradually increased with time, and the score in experimental group was higher in the control group (P<0.05), but did not reach normal levels. After four weeks, BBB scores in the experimental group increased more significantly than that in the control group, and the difference was statistically significant (P<0.05). (2) immunohistochemical staining showed that rat spinal cord at each time point in the experimental group and model control group, the expressions of myelin basic protein are higher than those in the sham group; and the experimental group was higher (P<0.05). Conclusion: Allogeneic bone marrow mononuclear cell transplantation may change the local microenvironment and raise its expression in the spinal cord myelin basic protein.

bone marrow mononuclear cells；transplantation；transected injury；myelin basic protein

黑龙江省教育厅科学技术研究项目， 编号：12511539。

季庆辉(1983～)男，黑龙江黑河人，硕士，医师。

杨建华( 1969 ～)男，黑龙江佳木斯人 ，硕士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail: jianhua01@163.com。

R683.2

A

1008-0104(2015)01-0066-03

2014-09-16)